Vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli que comprende una parte de la región procedente del pTb6 que comprende una región del origen de replicación (oriV)-repB del pTB6 pero que no comprende las regiones MembB,

MobA, Orfl y oriT del pTB6 y una parte del plásmido procedente de Escherichia coli que comprende una región del origen de replicación (ori) de Escherichia coli

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli; a un vector de expresión que puede expresar un gen deseado en un microorganismo del género Bifidobacterium mediante la utilización del vector lanzadera; a un microorganismo del género Bifidobacterium 5 transformado con el vector de expresión; y a un agente antitumoral que comprende el microorganismo del género Bifidobacterium como principio activo.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

La Bifidobacterium longum es una bacteria anaerobia Gram-positiva y que presenta un genoma con un gran contenido en GC (véase por ejemplo, el Documento 1 no de patente). Esta Bifidobacterium longum no es 10 patógena y constituye la mayor parte de la microflora normal en el intestino delgado de la especie humana y de otros animales (véase por ejemplo, el Documento 2 no de patente). Este microorganismo se dice que tiene propiedades de estimulación de la salud del hospedador tal como el aumento de la inmunorreacción (véase por ejemplo, el Documento 3 no de patente), efecto inhibidor del comienzo del cáncer (véase por ejemplo, el Documento 4 no de patente), la protección del los hospedadores contra la infección vírica (véase por ejemplo, los 15 Documentos 5 y 6 no de patente) y posiblemente de producción de sustancias antibacterianas (véase por ejemplo, el documento 7 no de patente). Algunos microorganismos del género Bifidobacterium son muy utilizados mundialmente en la preparación de productos lácteos fermentados.

Además, cabe esperar que los plásmidos del género Bifidobacterium se apliquen a los vectores probióticos y a los vectores de vacunas bucales contra enfermedades infecciosas. Recientes publicaciones han dado a conocer 20 que la Bifidobacterium longum se acumula en el tumor sólido hipóxico después de la administración general (véase por ejemplo, los Documentos 8 y 9 no de patente) y que un plásmido recombinante pBLES100-S-eCD portador de codA de Escherichia coli fusionado con un activador hup de Bifidobacterium longum expresa la citosina desaminasa en microorganismos (véase por ejemplo, el Documento 1 de patente y los documentos 10 y 11 no de patente). Esto confirmó la teoría de que el Bifidobacterium longum recombinante es eficaz para la terapia de enzima-profármaco. 25 Sin embargo, aunque estos plásmidos están atrayendo la atención en los campos de la alimentación, de los productos farmacéuticos y en la industria, sus propiedades genéticas son poco conocidas debido a la falta de un sistema de transferencia génica replicable eficaz.

El pBLES100, que se utilizó en la construcción del plásmido pBLES100-S-eCD recombinante, es un vector lanzadera construido a partir del plásmido pTB6 de una DK51 de Bifidobacterium longum y el plásmido pBR322 de 30 Escherichia coli (véase por ejemplo, el Documento 12 no de patente). Este vector lanzadera pBLES100 transformó la Bifidobacterium longum con una eficacia de 2,2 x 104 transformantes/μg de ADN y era estable en las células en cuanto a la estructura y segregación de fenotipos (véase por ejemplo, el Documento 13 no de patente). Sin embargo, como el plásmido que presenta ADN inalterado puede escindirse con una enzima de restricción en el microorganismo durante la transfección, la clonación de un gen extraño requiere gran eficacia de transformación. 35

Documento 1 de patente: solicitud de patente nº 2002-97144 japonesa abierta al público

Documento 1 no de patente: Scardovi, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology vol 2, eds. Sneath et al., pp. 1418-1434 (1986)

Documento 2 no de patente:Mitsuoka,Elsevier Applied Science, pp 69-114 (1992)

Documento 3 no de patente: Yasui et al., J. Dairy Sci., 74, 1187-1195 (1991) 40

Documento 4 no de patente: Reddy et al., Cancer Res., 53, 3914-3918 (1993)

Documento 5 no de patente: Duffy et al., Pediatr. Res., 35, 690-695 (1994)

Documento 6 no de patente: Saaverdra et al., Lancet., 344, 1046-1049 (1994)

Documento 7 no de patente: Ibrahim et al., J. Food Prot., 56, 713-715 (1993)

Documento 8 no de patente: Yazawa et al., Cancer Gene Ther. , 7, 269-274 (2000) 45

Documento 9 no de patente: Yazawa et al., Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170 (2001)

Documento 10 no de patente: Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366 (2002)

Documento 11 no de patente: Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-203 (2002)

Documento 12 no de patente: Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1212 (1997)

Documento 13 no de patente: Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1212 (1997) 50

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[Problema que debe resolver la invención]

Tal como se describió anteriormente, un vector lanzadera pBLES100 para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli transformó Bifidobacterium longum con a una eficiencia de 2,2 x 104 transformantes/μg de ADN y resultaba estable en las células en cuanto a la estructura y segregación de fenotipos. 5 Sin embargo, como el plásmido que tiene ADN inalterado puede escindirse con una enzima de restricción en el microorganismo durante la transfección, la clonación de un gen extraño requiere mayor eficacia de transformación. El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli con una amplia gama de hospedadores y un número grande de copias en los microorganismos del género Bifidobacterium y que puede expresar en gran medida una proteína deseada en un 10 microorganismo del género Bifidobacterium cuando se utiliza como vector de expresión; un vector de expresión que puede expresar un gen deseado en un microorganismo del género Bifidobacterium mediante la utilización del vector lanzadera; un microorganismo del género Bifidobacterium transformado con el vector de expresión; y un agente antitumoral que comprende el microorganismo del género Bifidobacterium como principio activo.

[Medios para resolver los problemas] 15

Se determinó la secuencia completa (3624 pb; SEC. ID. nº 1) de un plásmido pTB6 procedente de BK51 de Bifidobacterium longum e identificaron algunas secuencias génicas de este microorganismo del género Bifidobacterium que incluyen el origen de replicación OriV del plásmido. Se observó que OriV es una secuencia de 358 pb que contiene dso y sso, y que un fragmento procedente del pTB6 de aproximadamente 1900 pb en toda su longitud que contiene una proteína de replicación (RepB, 693 pb) está disponible como “unidad de replicación de un 20 microorganismo del género Bifidobacterium”. La capacidad de replicación no se confirmó para una unidad que contenía OriV y una parte de RepB. Se completó la presente invención observando que la expresión de un producto para la expresión de un gen de resistencia a la ampicilina que actúa como marcador selectivo, particularmente la expresión de la región N terminal del mismo, es desfavorable en cuanto a la expansión de una gama de hospedadores en los microorganismos del género Bifidobacterium. 25

Es decir, la presente invención se refiere a (1) un vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli caracterizado porque comprende una parte de la región procedente de pTB6 que comprende una región (oriV)-repB origen de replicación de pTb6 pero que no comprende las regiones MembB, MobA, OrfI y oriT de pTB6 y una parte del plásmido procedente de Escherichia coli que comprende una región origen (ori) de replicación de Escherichia coli; (2) el vector lanzadera para un microorganismo del género 30 Bifidobacterium y Escherichia coli según (1), en el que la parte de la región procedente del pTB6 consiste en una parte de la región procedente de TB6 que comprende una secuencia nucleotídica de 1260 pb constituida por una secuencia nucleotídica representada por los nucleótidos 305 al 1564 en la SEC. ID. nº 1; (3) vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli según (1) ó (2), en el que la parte del plásmido procedente de Escherichia coli que comprende una región origen (ori) de replicación es una parte del plásmido que 35 no comprende un gen de resistencia a la ampicilina (ampR) o que tiene ADN suprimido que codifica una región con terminal N de producto de expresión β-lactamasa del... [Seguir leyendo]

1. Vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli que comprende una parte de la región procedente del pTb6 que comprende una región del origen de replicación (oriV)-repB del pTB6 pero que no comprende las regiones MembB, MobA, Orfl y oriT del pTB6 y una parte del plásmido procedente de Escherichia coli que comprende una región del origen de replicación (ori) de Escherichia 5 coli.

2. Vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli según la reivindicación 1, en el que la parte de la región procedente del pTB6 está constituida por una parte de la región procedente del pTb6 que comprende una secuencia nucleotídica de 1260 pb constituida por una secuencia nucleotídica representada por los nucleótidos 305 a 1564 en la SEC. ID. nº 1. 10

3. Vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli según la reivindicación 1 ó 2, en el que la parte del plásmido procedente de Escherichia coli que comprende una región del origen de replicación (ori) de Escherichia coli es una parte del plásmido, no comprendiendo la parte del plásmido un gen para la resistencia a la ampicilina (ampR) o que tiene ADN que codifica una región con terminal N que carece de β-lactamasa. 15

4. Vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el microorganismo del género Bifidobacterium es Bifido

bacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum o Bifidobacterium adolescentis.

5. Vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el vector lanzadera presenta un número de copias medio de 6 a 30. 20

6. Vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el vector lanzadera se obtiene mediante las etapas siguientes:

(1) una etapa de preparación de un fragmento largo escindiendo y eliminando la secuencia del gen para la resistencia a la ampicilina del pGFPuv con las enzimas de restricción Eam1105I y ScaI;

(2) una etapa de preparación de un fragmento que contiene espectinomicina adeniltransferasa (casete 25 AAD) permitiendo que actúen las enzimas de restricción Eam1105I y ScaI en una secuencia procedente de Enterococcus faecalis que contiene la casete AAD;

(3) una etapa de preparación del plásmido pGFPuv_Spr ligando los fragmentos de la etapa (1) y (2) mediante la utilización de T4 ADN ligasa;

(4) una etapa de preparación del plásmido pAVN del que se ha suprimido el gen GFPuv, digeriendo 30 pGFPuv-SpR con las enzimas de restricción SalI y SpeI;

(5) una etapa de realización de RCP para pTB6 destinada a ampliar la secuencia que contiene RepB, SDO, DDO, repeticiones abundantes en AT y motivos de unión a DnaA, y para añadir la secuencia ApaI y la secuencia ScaI a ambos extremos de los productos de la RCP;

(6) una etapa de preparación del plásmido pCRTOTO-ApaI-1900-ScaI subclonando el fragmento 35 ampliado en la etapa (5) en el vector pCR-BlunII-TOPO; y

(7) una etapa de preparación de un vector lanzadera ligando el fragmento obtenido digeriendo el plásmido pAVN con ApaI y ScaI, y el fragmento obtenido digeriendo pCRTOTO-ApaI-1900-ScaI con ApaI y ScaI mediante la utilización de T4 ADN ligasa.

7. Vector de expresión que puede expresar un gen deseado en un microorganismo del género 40 Bifidobacterium, que comprende el vector lanzadera para un microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se inserta una unidad de expresión del gen deseado ligado en el marco entre un activador y un terminador implicados en la expresión de un gen procedente de Bifidobacterium longum que codifica una proteína de unión al ADN similar a una histona (proteína HU). 45

8. Vector de expresión según la reivindicación 7, en el que el gen deseado es un gen que codifica una citocina o un inhibidor angiógeno con actividad antitumoral o un gen que codifica una enzima que puede convertir un precursor de la sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral.

9. Vector de expresión según la reivindicación 8, en el que el gen que codifica una enzima que puede convertir un precursor de la sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral es un gen de la citosina 50 desaminasa.

10. Microorganismo del género Bifidobacterium transformado con el vector lanzadera para un

microorganismo del género Bifidobacterium y Escherichia coli según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Microorganismo del género Bifidobacterium según la reivindicación 10, que es Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium thermophirum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis o Bifidobacterium animalis.

12. Microorganismo del género Bifidobacterium transformado con el vector de expresión según cualquiera 5 de las reivindicaciones 7 a 9.

13. Microorganismo del género Bifidobacterium según la reivindicación 12, que es Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium thermophirum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, o Bifidobacterium animalis.

14. Agente antitumoral que comprende el microorganismo del género Bifidobacterium según la 10 reivindicación 12 ó 13 como principio activo.

15. Unidad de replicación de plásmido procedente del pTB6 de un microorganismo del género Bifidobacterium que comprende una región repB del origen de replicación (oriV) de pTB6 pero que no comprende las regiones MembB, MobA, Orfl y oriT de pTB6.

16. Unidad de replicación del plásmido procedente de pTB6 del microorganismo del género 15 Bifidobacterium según la reivindicación 15, que comprende la secuencia nucleotídica de 1260 pb constituida por una secuencia nucleotídica representada por los nucleótidos 305 a 1564 en la SEC. ID. nº 1.