Una FSH mutante, en la que la subunidad &946; comprende la SEQ ID NO: 3 y en la que la subunidad &945; comprende la SEQ ID NO: 4

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a la reproducción humana. Más específicamente, la presente invención se refiere a terapias de fertilización.

2. Descripción de la técnica relacionada

a. Gonadotropinas

La hormona estimuladora de los folículos (FSH) es un miembro de la familia de las gonadotrofinas que juega papeles clave en la fertilidad humana. Las gonadotrofinas, que también incluyen la hormona luteinizante (LH) y la gonadotrofina coriónica (CG), son heterodímeros, que consisten cada una en una subunidad α común (92 aminoácidos) y una subunidad β única (111 aminoácidos en la FSH). Las secuencias de aminoácidos de las formas maduras de las subunidades α y β de la FSH se muestran en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente.

La FSH humana ha sido aislada de las glándulas pituitarias y de la orina postmenopáusica (patente europea EP 322.438) y ha sido producida de manera recombinante en células de mamíferos (patentes de EE.UU. 5.639.640, 5.156.957, 4.923.805, 4.840.896, 5.767.251, patentes europeas EP 211.894 y EP 521.586). Estas últimas referencias también describen del gen de la subunidad β de la FSH humana. La patente de EE.UU. 5.405.945 describe un gen de la subunidad α humana modificado que comprende sólo un intrón.

Liu et al., J Biol Chem 1993,15; 268 (2): 21613-7, Grossmann et al., Mol Endocrinol 1996 10 (6): 769-79, Roth y Dias (Mol Cell Endocrinol 1995 1; 109 (2): 1439, Valove et al., Endocrinology 1994; 135 (6): 2657-61, Yoo et al., JBiol Chem 1993 25; 268 (18): 13034-42), patente de EE.UU. 5.508.261 y Chappel et al., 1998, Human Reproduction, 13 (3): 1835 describen diversos estudios de relación estructura-función e identifican residuos de aminoácidos implicados en la unión con receptores y activación y en la dimerización de la FSH.

b. Uso de gonadotropinas en técnicas de reproducción asistida

Las gonadotrofinas juegan papeles cruciales en el ciclo reproductivo, y su uso en terapias exógenas es esencial para las técnicas de reproducción asistida (TRA), tales como fertilización in vitro (FIV), FIV junto con inyección espermática intracitoplásmica (FIV/ICSI) y transferencia de embriones (TE), así como para la inducción de la ovulación (IO) en pacientes anovulatorias que se someten a fertilización in vivo bien de manera natural o bien mediante inseminación intrauterina (IIU).

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Las patentes de EE.UU 4.589.402 y 4.845.077 describen FSH humana purificada que está exenta de LH y el uso de la misma para fertilización in vitro. La patente europea EP 322 438 describe una proteína con al menos 6200 U/mg de actividad FSH que está sustancialmente exenta de actividad LH, y en la que la subunidad α y la subunidad β de la FSH, respectivamente, pueden ser naturales o formas truncadas especificadas de las mismas.

Es necesaria una terapia prolongada para conseguir un efecto terapéutico, típicamente durante 8-10 días consecutivos y a veces hasta 21 días para estimular la foliculogénesis en las mujeres, y durante hasta 18 meses en varones hipogonadotróficos para inducir la espermatogénesis. La hFSH recombinante se administra típicamente como una inyección diaria i.m. ó s.c., con la consiguiente incomodidad y una potencial reacción local en el sitio de inyección. Disminuir la frecuencia de administración facilitaría la terapia y haría que la administración de gonadotrofinas fuera más conveniente, más tolerable y llevadera para el paciente.

c. Glicosilación de la FSH

Las gonadotrofinas son glicoproteínas, teniendo cada subunidad cadenas laterales de oligosacáridos enlazados a la asparragina (enlazados en N) que son importantes para la actividad y función in vivo. La adición de carbohidratos (glicosilación) a polipéptidos es un evento post-translacional que da como resultado la adición de cadenas de azúcares a aminoácidos específicos de asparragina (enlazados en N) o serina/treonina (enlazados en O). En contraste con la invariante secuencia de aminoácidos de la porción proteínica de las glicoproteínas, las estructuras de los carbohidratos son variables, un rasgo denominado microheterogeneidad. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilación sobre la misma proteína pueden contener diferentes estructuras de carbohidratos. Además, incluso en el mismo sitio de glicosilación sobre una glicoproteína dada, se pueden encontrar diferentes estructuras de carbohidratos. Esta heterogeneidad es una consecuencia de la síntesis no dirigida por plantillas de los carbohidratos.

La N-glicosilación de proteínas se produce específicamente en el patrón de consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, y en menor grado en el patrón de consenso Asn-Xaa-Cys, donde Xaa puede ser cualquier residuo de aminoácido. Sin embargo, la presencia de un tripéptido de consenso no es suficiente para asegurar que se glicosilará un residuo de asparragina. Por ejemplo, la N-glicosilación de la secuencia Asn-Pro-Ser/Thr se produce a una tasa de 50 veces más baja que los otros patrones de consenso de Asn-Xaa-Ser/Thr.

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La FSH humana contiene cuatro sitios de glicosilación enlazada a N: dos sobre la subunidad α común en las posiciones 52 y 78 y dos sobre la subunidad β en las posiciones 7 y 24. Los carbohidratos unidos a la subunidad α de la FSH son críticos para el ensamblaje del dímero, la integridad, la secreción y transducción de señales, mientras que los carbohidratos de la subunidad β son importantes para el ensamblaje del dímero, secreción y eliminación del heterodímero de la circulación.

Galway et al., Endocrinology 1990; 127(1): 93-100 demuestran que las variantes de la FSH producidas en una línea celular CHO de N-acetilglucosamina transferasa-I o una línea celular CHO defectiva en transporte de ácido siálico son tan activas como la FSH secretada por las células naturales o la FSH de la pituitaria purificada in vitro, pero carecen de actividad in vivo, presumiblemente debido a la rápida eliminación de las variantes inadecuadamente glicosiladas en el suero. D'Antonio et al., Human Reprod 1999; 14(5): 1160-7 describen diversas isoformas de la FSH que circulan en la corriente sanguínea. Las isoformas tienen secuencias de aminoácidos idénticas, pero difieren en su grado de modificación post-translacional. Se encontró que el grupo de isoformas menos ácido tenía una eliminación in vivo más rápida en comparación con el grupo de isoformas ácido, debido posiblemente a diferencias en el contenido de ácido siálico entre las isoformas. Además, Bishop et al. Endocrinology 1995; 136(6): 2635-40 concluyen que la vida media circulatoria parece ser el determinante principal de la actividad in vivo. Estas observaciones condujeron a la hipótesis de que la vida media de la FSH podría ser aumentada introduciendo sitios de glicosilación adicionales para aumentar el contenido de ácido siálico del polipéptido.

d. Variantes de la FSH

Se han desarrollado agonistas de la FSH con vidas medias aumentadas fusionando el péptido carboxiterminal de la hCG (CTP) a FSH humana recombinante nativa (rhFSH). El resto CTP consiste en los aminoácidos 112-118 a 145 con cuatro sitios de glicosilación enlazados a O localizados en las posiciones 121, 127, 132 y 138. Las patentes de EE.UU. 5.338.835 y 5.585.345 describen una subunidad β de la FSH modificada extendida en el Glu C-terminal con el resto CTP de la hCG. Se afirma que el análogo modificado resultante tiene la actividad biológica de la FSH nativa, pero una vida media circulante prolongada. La patente de EE.UU. 5.405.945 describe que la parte carboxiterminal de la subunidad β de la hCG o una variante de la misma tiene efectos significativos sobre la eliminación de CG, FSH y LH.

La patente de EE.UU. 5.883.073 describe proteínas de cadena única comprendidas de dos subunidades α con actividad agonista o antagonista para CG,

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TSH, LH FSH. La patente de EE.UU. 5.508.261 describe polipéptidos heterodiméricos que tienen afinidad de unión a receptores de la LH y FSH que comprenden una subunidad α de hormona de glicoproteína y un polipéptido de subunidad β que no existe en la naturaleza, en donde el polipéptido de la subunidad β es una cadena de aminoácidos que comprende cuatro subsecuencias unidas, cada una de las cuales se selecciona de una lista de secuencias específicas. Klein et al. (2003) describen un análogo de cadena única de la FSH con una vida media aumentada, en el que...

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1. Una FSH mutante, en la que la subunidad β comprende la SEQ ID NO: 3 y en la que la subunidad α comprende la SEQ ID NO: 4.

2. La FSH mutante de la reivindicación 1, en la que uno cualquiera de 0 a 6 residuos de asparragina están glicosilados.

3. La FSH mutante de la reivindicación 1, en la que el residuo N3 de la subunidad α está glicosilado.

4. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

5. El vector de la reivindicación 4, en donde el vector es un vector de expresión.

6. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 4.

7. La célula huésped de la reivindicación 6, en donde la célula es una célula de un mamífero.

8. Un método para producir la FSH mutante de la reivindicación 1, que comprende:

(a) proporcionar una célula que comprende un primer ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y un segundo ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;

(b) cultivar la célula bajo condiciones que permitan la expresión del primer y segundo ácidos nucleicos.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la célula es capaz de glicosilar proteínas.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la célula comprende un único vector que comprende un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la

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SEQ ID NO: 3 y un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

11. El método de la reivindicación 9, en el que la célula comprende: (a) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y

(b) un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

10 12. Una composición farmacéutica que comprende la FSH mutante de la reivindicación 1 y opcionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición farmacéutica de la reivindicación 12 para tratar un mamífero 15 infértil.

14. Una composición farmacéutica de la reivindicación 12 para estimular la foliculogénesis en un mamífero.

20 15. Una composición farmacéutica de la reivindicación 12 para inducir la hiperestimulación ovárica en un mamífero.