Procedimiento para someter a ensayo variantes del MC1R y marcadores mitocondriales en muestras de piel.

Un procedimiento de diagnóstico para determinar el estado de la piel y la predisposición genética de un sujeto al daño por RUV,

que comprende:

(a) someter a ensayo una muestra de piel del sujeto para una anomalía en el ADN mitocondrial (ADNmt), en el que la anomalía es una deleción de 3895 pb en el ADNmt entre los nucleótidos 546 a 4444 del genoma del ADNmt;

(b) someter a ensayo una muestra de tejido del sujeto para una o más variantes del receptor de melanocortina 1 (MC1R), en el que las una o más variantes del MC1R se seleccionan del grupo que consiste en D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L y V92M; y

(c) determinar el estado de la piel y la predisposición genética del sujeto al daño por RUV basándose en la detección de la anomalía en el ADNmt y la(s) variante(s) del MC1R en las muestras de piel y tejido, respectivamente.

Procedimientos para someter a ensayo variantes del MC1R y marcadores mitocondriales en muestras de piel

Objeto de la Invención La presente invención se refiere a procedimientos para predecir, diagnosticar y supervisar estados de la piel y enfermedades de la piel. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos que vinculan técnicas de muestreo de piel no invasivas con ensayos para determinar mutaciones mitocondriales y variantes del receptor de melanocortina 1 (MC1R) para su uso como herramienta integral para predecir y supervisar enfermedad, fotoenvejecimiento y daño por radiación ultravioleta (RUV) . Los procedimientos también son útiles para evaluar la eficacia y la respuesta ante agentes terapéuticos, productos para el cuidado de la piel y regímenes de tratamiento.

Antecedentes de la Invención La enfermedad de la piel representa uno de los principales retos de la atención sanitaria en el mundo actual. Con más de un millón de casos nuevos de cáncer de piel diagnosticados cada año en Estados Unidos (National Cancer Institute, www.cancer.gov) , la predicción y el diagnóstico de la enfermedad de la piel son aspectos importantes de su abordaje. Los procedimientos de diagnóstico actuales se basan principalmente en observaciones visibles y biopsias. Sin embargo, los procedimientos de detección que se basan en observaciones visibles, no son necesariamente eficaces para diagnosticar estados o enfermedades de la piel y no detectan el riesgo de enfermedad hasta que se hayan producido manifestaciones clínicas. Además, los procedimientos invasivos tales como las biopsias, no sólo son traumáticos para un sujeto que se somete a la prueba, sino que también aumentan la probabilidad de infección. Estos procedimientos también los debe realizar un médico para que se desarrollen con seguridad y, típicamente, no proporcionan una muestra enriquecida de células de la superficie de la piel, que son las células que, por lo general, participan en una reacción.

Por lo tanto, los procedimientos no invasivos de diagnóstico y supervisión de estados y enfermedades de la piel, representan herramientas importantes para la atención de los pacientes y para evaluar la eficacia de agentes terapéuticos existentes y nuevos, productos para el cuidado de la piel y regímenes de cuidado de la piel. Además, estos procedimientos pueden proporcionar información importante en relación con los cambios genéticos específicos subyacentes al estado de la piel de un sujeto, así como su predisposición genética a desarrollar una enfermedad de la piel. La identificación de estos cambios genéticos identifica posibles objetivos farmacológicos y medidas preventivas y puede ser esencial para determinar si una persona responderá realmente a un agente terapéutico, un producto para el cuidado de la piel o un tratamiento en particular. Asimismo, los procedimientos de detección y diagnóstico son importantes para evaluar la seguridad de estos tratamientos, productos y medidas.

Daño por radiación ultravioleta (RUV)

Con frecuencia, factores desconocidos o poco cuantificables contribuyen al daño de la piel como consecuencia de la radiación ultravioleta (RUV) . Los factores conocidos incluyen color de la piel, frecuencia e intensidad de la exposición a RUV, producción de melanina, ratio de eumelanina y feomelanina y uso de protectores solares, entre otros. Los factores conductuales desempeñan un papel importante en la gravedad y el nivel de daño de la piel por RUV, pero es extremadamente difícil evaluarlos clínicamente, ya que dependen de la precisión de la información aportada por el paciente y, con frecuencia, de una conciencia errónea de los hábitos de exposición al sol del paciente. Muchos individuos que usan bloqueadores solares regularmente también los usan de forma incorrecta, al aplicarlos en cantidad insuficiente o no aplicarlos de nuevo a los intervalos recomendados, lo que crea una falsa sensación de protección que puede dar lugar a un aumento de la exposición a la RUV.

Estos factores, entre otros, hacen necesaria la disponibilidad de una herramienta para supervisar de cerca del éxito y la idoneidad de las medidas preventivas y los tratamientos aconsejados para evitar el daño por RUV en la piel, con consecuencias en el espectro desde el envejecimiento prematuro hasta el aumento del riesgo de cáncer de piel. En un esfuerzo para valorar por completo el estado de la piel de un individuo, y como consecuencia su riesgo de fotoenvejecimiento y cáncer de piel, es indispensable que se proporcione a los profesionales sanitarios tanta información como sea posible para que conozcan y comuniquen los factores de riesgo de su paciente. Por lo tanto, sería deseable contar con un procedimiento de diagnóstico para evaluar la predisposición genética de un individuo a los efectos dañinos de la RUV, así como para identificar factores de riesgo asociados con los hábitos de exposición al sol particulares del individuo. Un procedimiento de este tipo puede incluir la recogida de una muestra de ADN de la epidermis o la dermis de la piel de un individuo para cuantificar los biomarcadores mitocondriales indicativos de daño por RUV, así como el genotipado del receptor de melanocortina 1 (MC1R) , para identificar variantes implicadas en el control de la melanogenia. El uso combinado de ambas pruebas en tándem proporciona una herramienta integral para que los profesionales sanitarios supervisen, aconsejen y traten a pacientes, al tener en cuenta tanto la predisposición genética del paciente al fotoenvejecimiento o el cáncer como las consecuencias de la exposición continuada del paciente a radiación ultravioleta.

Deleciones mitocondriales asociadas con la RUV

El tejido epitelial humano es muy complejo y comprende numerosos tipos de células. En consecuencia, la identificación de biomarcadores de células epiteliales humanas es de especial importancia. Para determinar un marcador fiable de exposición acumulada a RUV en la piel humana, los inventores y otros han estudiado la idea novedosa de usar ADN mitocondrial (ADNmt) , en lugar de ADN nuclear, como biomarcador de daño en el ADN inducido por UV (Pang et ál., 1994; Berneburg et ál., 1997; Birch-Machin et ál., 1998; Birch-Machin, 2000) .

El uso del daño en el ADNmt como biomarcador para la exposición al sol acumulada en la piel humana es un campo de investigación relativamente nuevo y el trabajo anterior simplemente ha comparado el daño en el ADNmt para distinguir entre la piel protegida frente al sol y la expuesta al sol (Pang et ál., 1994; Berneburg et ál., 1997; Birch-Machin et ál., 1998) . Este planteamiento es limitado porque el cáncer de piel no melanómico (CPNM) se forma predominantemente en sitios del cuerpo que están expuestos al sol "habitualmente" al estar al aire libre en oposición con los sitios que están expuestos al sol "ocasionalmente" (Armstrong, 2004) .

En la solicitud PCT del presente solicitante en trámite en relación con la publicación nº WO/06/111029, se identificó una deleción de 3895 pb en el ADN mitocondrial humano (ADNmt) como biomarcador del daño en el ADN inducido por UV. Esta deleción se identificó en el arco menor que se extiende de los nucleótidos 547 a 4443. Esta deleción se había asociado anteriormente con el síndrome de Kearns-Sayre y la oftalmoplejía externa progresiva crónica (Moraes et ál., 1995) .

Los ejemplos de la publicación PCT nº WO/06/111029 demuestran que la frecuencia de aparición de la deleción de 3895 pb en el ADNmt es significativamente diferente entre sitios del cuerpo que expuestos al sol "habitualmente" frente a "ocasionalmente". Además, los ejemplos demostraron la relación entre la etiología de la deleción de 3895 pb y el componente de RUV de la luz solar al inducir la deleción de 3895 pb in vitro con dosis subletales repetitivas de una fuente de luz UVA+UVB.

Es importante el hecho de que la muestras de piel analizadas en el documento WO/06/111029 no se evaluaron con respecto a la predisposición genética del individuo al daño solar y el riesgo de cáncer de piel. Además, estas muestras se obtuvieron por procedimientos dolorosos de toma de piel conocidos anteriormente en la técnica.

Genotipado del receptor de melanocortina 1 (MC1R)

El gen del receptor de melanocortina 1 (MC1R) codifica una proteína receptora unida a la membrana que es esencial para la síntesis de melanina. La región codificante del MC1R es muy polimórfica y se ha informado de asociaciones de variantes con fenotipos de pigmentación y riesgo de melanoma y cáncer de piel no melanómico (Rees, Pigment Cell Research, vol. 13 (3) , 135-140 (6) , junio de 2000; Kanetsky et ál. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention vol. 13, 808-819, mayo de 2004) . La tasa... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de diagnóstico para determinar el estado de la piel y la predisposición genética de un sujeto al daño por RUV, que comprende: 5

(a) someter a ensayo una muestra de piel del sujeto para una anomalía en el ADN mitocondrial (ADNmt) , en el que la anomalía es una deleción de 3895 pb en el ADNmt entre los nucleótidos 546 a 4444 del genoma del ADNmt;

(b) someter a ensayo una muestra de tejido del sujeto para una o más variantes del receptor de melanocortina 1 (MC1R) , en el que las una o más variantes del MC1R se seleccionan del grupo que consiste en D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L y V92M; y

(c) determinar el estado de la piel y la predisposición genética del sujeto al daño por RUV basándose

en la detección de la anomalía en el ADNmt y la (s) variante (s) del MC1R en las muestras de piel y tejido, respectivamente.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se obtuvo la muestra de piel usando una técnica de toma de piel no invasiva o mínimamente invasiva.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que se tomó la muestra de piel usando un hisopo estéril, un bastoncillo de algodón, una aguja de calibre pequeño para tomar micronúcleos de tejido epitelial o una combinación de los mismos.

2.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra de piel se tomó de la capa dérmica o epidérmica del sujeto.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra de piel procede del talón, nariz, parte interna del brazo, oreja, boca, cuero cabelludo, pecho, hombro, nalga, espalda, cara, nuca, mano, cabeza o una combinación de los mismos.

6. Uso del procedimiento de la reivindicación 1 para predecir fotoenvejecimiento, daño por RUV o enfermedad de la piel o para determinar un tratamiento profiláctico o terapéutico para evitar o mejorar el fotoenvejecimiento, daño por RUV o cáncer de piel.

3.

7. Un procedimiento para supervisar la respuesta de un sujeto a un tratamiento preventivo o terapéutico para el fotoenvejecimiento, daño por RUV o enfermedad de la piel, que comprende:

(a) someter a ensayo una primera muestra de piel del sujeto para una anomalía en el ADN mitocondrial (ADNmt) , en el que la anomalía es una deleción de 3895 pb en el ADNmt entre los nucleótidos 546 a 4444 del genoma del ADNmt;

(b) someter a ensayo una muestra de tejido del sujeto para una o más variantes del receptor de

melanocortina 1 (MC1R) , en el que las una o más variantes del MC1R se seleccionan del grupo que 45 consiste en D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L y V92M;

(c) determinar el estado de la piel y la predisposición genética del sujeto al daño por RUV basándose en la detección de la anomalía en el ADNmt en la primera muestra de piel y las una o más variantes del MC1R en la muestra de tejido;

(d) someter a ensayo una segunda muestra de piel del sujeto para la anomalía en el ADNmt transcurrido un periodo de tiempo prescrito después de un tratamiento preventivo o terapéutico para el fotoenvejecimiento, daño por RUV o enfermedad de la piel;

(e) repetir la etapa (d) en intervalos regulares a lo largo de un periodo de tiempo prescrito; y

(f) comparar el nivel de anomalía en el ADNmt entre la primera muestra de piel y las muestras de piel adquiridas en intervalos regulares para detectar cambios en la anomalía en el ADNmt, supervisando así la eficacia del tratamiento.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que se obtuvieron las muestras de piel usando una técnica de toma de piel no invasiva o mínimamente invasiva.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la técnica de toma de piel no invasiva o mínimamente 65 invasiva comprende obtener una cantidad suficiente de la muestra para dar niveles ultrabajos de ADN, tales como aproximadamente 0, 1 ng de ácido nucleico.

10. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dichos intervalos regulares son bisemanales o mensuales.

11. Un procedimiento de cribado para un agente terapéutico o cosmeticéutico eficaz para el tratamiento del 5 fotoenvejecimiento, daño por RUV o enfermedad de la piel, que comprende:

(a) someter a ensayo una primera muestra de piel de un sujeto para una anomalía en el ADN mitocondrial (ADNmt) , en el que la anomalía es una deleción de 3895 pb en el ADNmt entre los nucleótidos 546 a 4444 del genoma del ADNmt;

(b) someter a ensayo una muestra de tejido del sujeto para una o más variantes del receptor de melanocortina 1 (MC1R) , en el que las una o más variantes del MC1R se seleccionan del grupo que consiste en D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L y V92M;

(c) determinar el estado de la piel y la predisposición genética del sujeto al daño por RUV basándose en la detección de la anomalía en el ADNmt en la primera muestra de piel y las una o más variantes del MC1R en la muestra de tejido;

(d) someter a ensayo una segunda muestra de piel del sujeto para la anomalía en el ADNmt

transcurrido un periodo de tiempo prescrito después del tratamiento con el agente terapéutico o cosmeticéutico; y

(e) comparar el nivel de anomalía en el ADNmt en la primera muestra de piel y la segunda muestra de piel frente a un control para determinar la eficacia del agente terapéutico o cosmeticéutico. 25

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que se obtuvieron la primera muestra de piel y la segunda muestra de piel usando una técnica de toma de piel no invasiva o mínimamente invasiva.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 7 a 12, en el que la muestra de tejido 30 para el ensayo del MC1R comprende una muestra de tejido epitelial, una muestra de tejido bucal, una muestra de tejido muscular o una muestra de tejido nervioso.

14. Un kit de diagnóstico para determinar el estado de la piel y la predisposición genética de un sujeto al daño por RUV, que comprende: 35

(a) material para tomar muestras de tejido; y

(b) cebadores, sondas y reactivos adecuados para llevar a cabo el genotipado del receptor de melanocortina 1 (MC1R) y la detección de una anomalía en el ADN mitocondrial (ADNmt) ;

en el que la anomalía en el ADNmt es una deleción de 3895 pb en el ADNmt entre los nucleótidos 546 a4444 del genoma del ADNmt y en el que el genotipado del MC1R comprende someter a ensayo una o más variantes del MC1R seleccionadas del grupo que consiste en D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L y V92M.

Fig. 1

CT deleción Fig. 2

Fig. 3

Fig. 4

Fig. 5

Variantehomocigota

Fig. 12

agrup. edades

barras de error: +/-1, 00 DE

ANOVA

ctn

Suma de los cuadrados df Media cuadrática F Sig.

Entre grupos Dentro de grupos Total 125, 556 1165, 060 1290, 616 2 253 255 62, 778 4, 605 13, 633 0, 000

Fig. 13