Polipéptidos de larga duración de acción y procedimientos para producirlos y administrarlos.

Un polipéptido que se compone de un péptido de interés, en donde una gonadotropina coriónica de péptido con carbonilo terminal (PCT) está unida a un termino amino de dicho péptido de interés,

y una segunda y tercera terminal carboxilo de gonadotropina coriónica está unida

al termino carboxilo de dicho péptido de interés, en donde dicho péptido de interés es un péptido de eritropoyetina (EPO),

en donde el PCT es de una subunidad beta de la gonadotropina coriónica, en donde el PCT se compone de la secuencia de aminoácido SSSSKAPPPS, y en donde el péptido EPO estimula la eritropoyetina.

Polipéptidos de larga duración de acción y procedimientos para producirlos y administrarlos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se divulgan un polipéptido y polinucleótidos que codifican los mismos péptidos con carboxilo terminal (PCT) de gonadotropina coriónica unido a un péptido de interés. También se divulgan las composiciones farmacéuticas que comprenden al polipéptido y los polinucleótidos de la invención y los métodos para usarlos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los polipéptidos son susceptibles a la desnaturalización o degradación enzimática en la sangre, hígado o riñón. En consecuencia, los polipéptidos, generalmente, tienen semividas de circulación cortas de varias horas. Debido a su baja estabilidad, los medicamentos con péptidos, generalmente, se suministran con una frecuencia prolongada a fin de mantener una concentración plasmática eficaz del péptido activo. Además, debido a que los medicamentos con péptidos, generalmente, se suministran por infusión, la inyección frecuente de medicamentos con péptidos ocasionan un malestar considerable al sujeto. Por lo tanto, existe la necesidad de tecnologías que prolonguen las semividas de polipéptidos terapéuticos al mismo tiempo que mantengan una alta eficacia farmacológica de estos. Tales medicamentos con péptidos deseados también deberían cumplir con los requisitos de contar con una estabilidad mejorada del suero, alta actividad y baja probabilidad de inducir una respuesta inmunológica indeseada al inyectarlos en un sujeto. Farmacocinéticas no favorables, como una semivida corta en suero, pueden prevenir el desarrollo farmacéutico de muchos medicamentos candidatos prometedores. La semivida en suero es una característica empírica de una molécula y debe determinarse experimentalmente para cada nuevo medicamento potencial. Por ejemplo, los medicamentos de polipéptido con peso molecular inferior, mecanismos fisiológicos de depuración como la filtración renal pueden hacer que el mantenimiento de niveles terapéuticos de un medicamento no sea factible debido al costo o la frecuencia del régimen de dosis requerido. En cambio, la semivida larga en suero no es deseable cuando un medicamento o sus metabolitos tienen efectos secundarios tóxicos. EE.UU. 5.759.818 divulga péptidos y proteínas modificados que cuentan con actividad biológica, los que contienen extensiones que representan el péptido con carboxilo terminal de gonadotropina coriónica humana o fragmentos de estos. Dichos péptidos y proteínas modificados cuentan con propiedades de depuración más deseables en comparación con los péptidos o proteínas sin modificar correspondientes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En una realización, la presente invención proporciona un polipéptido que consiste de una primera secuencia PCT AA (aminoácido) de gonadotropina coriónica unida al extremo amino-terminal de una secuencia de interés del péptido, y una segunda y tercera secuencia PCT AA unida al extremo carboxiterminal de la secuencia de interés del péptido, donde la secuencia de interés del péptido es un péptido de eritropoyetina (EPO) , en donde el PCT es de una subunidad beta de la gonadotropina coriónica, en donde el PCT consiste de la secuencia de aminoácidos SSSSKAPPPS, y en donde el péptido EPO estimula la eritropoyetina.

El péptido EPO de interés puede ser glicosilado o no glicosilado. El péptido EPO puede componerse de la secuencia de aminoácidos N. º ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 6. Al menos uno de los péptidos con carboxilo terminal de gonadotropina coriónica puede componerse de la

secuencia de aminoácidos de N. º ID SEC: 17 o N. º ID SEC: 18. Al menos uno de los péptidos con carboxilo terminal de gonadotropina coriónica puede estar truncado y

componerse de al menos un sitio de glicosilación. Al menos uno de los péptidos con carboxilo terminal de gonadotropina coriónica puede estar glicosilado. El polipéptido puede además componerse de un péptido de señal, y el péptido de señal puede

componerse de la secuencia de aminoácidos N. º ID SEC: 19.

En otra realización, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención.El polinucleótido puede componerse de la secuencia de aminoácido N. º ID SEC: 21. En una realización adicional, la presente invención proporciona un vector de expresión que se compone del polinucleótido de la invención. En una realización adicional, la presente invención proporciona una célula que se compone del vector de expresión de la invención. En otra realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que se compone de un polipéptido, polinucleótido, vector de expresión o célula de la invención. En otra realización, la presente invención proporciona un método para mejorar la semivida biológica y retener una actividad biológica de una secuencia de interés del péptido; el método se compone del paso de unir una primera secuencia PCT AA de gonadotropina coriónica al extremo amino-terminal de una secuencia de interés del péptido y unir una segunda y tercera secuencia PCT AA al extremo carboxiterminal de la secuencia de interés del péptido, lo que mejora, por lo tanto, la semivida biológica del péptido de interés, en donde el péptido de interés es eritropoyetina (EPO) , en donde el PCT es de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana, en donde el PCT consiste de la secuencia de aminoácidos SSSSKAPPPS y en donde el péptido EPO estimula la eritropoyesis. En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido o un polinucleótido de la invención y lo usa en el tratamiento o la reducción de la incidencia asociada con anemia en un sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIAGRAMAS

Las Figuras 1A-1 F son diagramas que ilustran seis conceptos EPO-PCT. La Figura 1A -es un diagrama del polipéptido del N.o ID SEC: 1 La Figura 1B es un diagrama del polipéptido del N.o ID SEC: 2 La Figura 1C es un diagrama de un polipéptido del N.o ID SEC: 3 La Figura 1D es un diagrama de un polipéptido de N.o ID SEC: 4. La Figura 1E es un diagrama de un polipéptido de N.o ID SEC: 5. La Figura 1F es un diagrama de un polipéptido del N.o ID SEC: 6. La Figura 2 es una fotografía que ilustra la expresión de las variantes EPO-PCT de las células DG44 transfectadas. Las muestras del ensayo final de las células transfectadas se prepararon como se describe en "preparación de muestra" y se ejecutaron en SDS/PAGE. Las proteínas se detectaron por Western Blot. La Figura 3 es una gráfica que ilustra la bioactividad in vivo de los derivados hEPO recombinantes y EPO-3 (N.o ID SEC: 3) . Los ratones ICR (n=7/grupo) recibieron una sola inyección IV/semana (15 mg/kg) durante tres semanas de EPO-3, rhEPO-WT (N.oID SEC: 16) , Recormon (EPO comercial) o Recormon (5 mg/kg) 3 veces a la semana. Los animales de control se inyectaron IV con PBS. Se recolectaron muestras de sangre tres veces a la semana, y se detectaron niveles de hematocrito. Cada punto representa el grupo promedio de hematocrito (%) ± SE. La Figura 4 es una gráfica que ilustra la bioactividad in vivo de los derivados hEPO recombinantes y EPO-1 (N.o ID SEC: 1) . Los ratones ICR (n=7/grupo) recibieron una sola inyección IV/semana (15 mg/kg) durante tres semanas de EPO-1, rhEPO-WT (N.o ID SEC: 16) , Recormon o Recormon (5 mg/kg) 3 veces a la semana. Los animales de control se inyectaron IV con PBS. Se recolectaron muestras de sangre tres veces a la semana, y se detectaron niveles de hematocrito. Cada punto representa el grupo promedio de hematocrito (%) ± SE. La Figura 5 es una gráfica que ilustra la bioactividad in vivo de los derivados hEPO recombinantes y EPO-2 (N.o ID SEC: 2) . Los ratones ICR (n=7/grupo) recibieron una sola inyección IV/semana (15 mg/kg) durante tres semanas de EPO-2 (N.o ID SEC: 2) , rhEPO-WT (N.o ID SEC: 16) , Recormon o Recormon (5 mg/kg) 3 veces a la semana. Los animales de control se inyectaron IV con PBS. Se recolectaron muestras de sangre tres veces a la semana, y se detectaron niveles de hematocrito. Cada punto representa el grupo promedio de hematocrito (%) ± SE. La Figura 6 es una gráfica de tiempo que ilustra el cambio en el nivel de reticulocitos después de una sola dosis bolo de EPO-0 (N.o ID SEC: 16) , EPO-3 (N.o ID SEC: 3) y Aranesp. La Figura 7 es una gráfica de tiempo que ilustra el cambio en el nivel de hemoglobina (presentado como un cambio desde la línea base) después de una sola dosis bolo de EPO-0 (N.o ID SEC: 16) , EPO-3 (N.o ID SEC: 3) y Aranesp. La Figura 8 es una gráfica de tiempo que ilustra el cambio en el nivel de hematocrito después de una sola dosis bolo de EPO-0 (N.o ID SEC: 16) , EPO-3 (N.o ID SEC: 3) y Aranesp.

La Figura 9 es una gráfica que ilustra el cambio en concentración... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que se compone de un péptido de interés, en donde una gonadotropina coriónica de péptido con carbonilo terminal (PCT) está unida a un termino amino de dicho péptido de interés, y una segunda y tercera terminal carboxilo de gonadotropina coriónica está unida al termino carboxilo de dicho péptido de interés, en donde dicho péptido de interés es un péptido de eritropoyetina (EPO) , en donde el PCT es de una subunidad beta de la gonadotropina coriónica, en donde el PCT se compone de la secuencia de aminoácido SSSSKAPPPS, y en donde el péptido EPO estimula la eritropoyetina.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, donde dicho péptido de interés es glicosilado.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho péptido de interés es no glicosilado.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde la secuencia de dicho péptido EPO se compone de una secuencia de aminoácido seleccionado desde las secuencias previstas en Nº ID SEC: 3 y el Nº ID SEC:6.

5. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la secuencia de al menos una terminal carboxilo de gonadotropina coriónica se compone de una secuencia de aminoácido seleccionada desde las secuencias previstas en Nº ID SEC: 17 y

Nº ID SEC: 18.

6. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la secuencia de al menos una gonadotropina coriónica con péptido con carbonilo terminal se truncó, y en donde dicho péptido con carboxilo terminal se compone de al menos un sitio de glicosilación.

7. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde al menos una gonadotropina coriónica de péptido con carbonilo terminal es glicosilada.

8. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se componen además de un péptido de señal.

9. El polipéptido de la reivindicación 8, en donde el péptido de señal se compone de una secuencia de aminoácido previstas en Nº ID SEC: 19.

10. Una composición farmacéutica que se compone del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un polinucleótidos que codifican el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. El polinucleótido de la reivindicación 11, en donde la secuencia del ácido nucleico se compone de la secuencia

prevista en Nº ID SEC: 21.

13. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en donde dicho polipéptido se compone además de un péptido de señal.

14. Un vector de expresión que se compone del polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

15. Una célula que comprende el vector de expresión de la reivindicación 14.

16. Una composición farmacéutica que se compone del polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, el vector de expresión de la reivindicación 14, la célula de la reivindicación 15 o su combinación.

17. Un método para mejorar la media vida biológica y retención de una actividad biológica de un péptido de interés, que se compone del paso de unir una primera gonadotropina coriónica de péptido con terminal carboxi (PCT) a la terminal amino de dicho péptido de interés y una gonadotropina coriónica con péptido de terminal carboxi a la terminal carboxi de dicho péptido de interés, mejorando por lo tanto la semivida biológica de dicho péptido de interés, en donde dicho péptido de interés es eritropoyetina (EPO) , en donde el PCT es de una subunidad beta de la gonadotropina coriónica, en donde el PCT se compone de la secuencia de aminoácido SSSSKAPPPS, y en donde el péptido EPO estimula la eritropoyetina.

18. El método de la reivindicación 17, donde la secuencia de al menos una terminal carboxilo de gonadotropina coriónica se compone de una secuencia de aminoácido seleccionada desde las secuencias previstas en Nº ID SEC: 17-18.

19. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el polinucleótidos de cualquiera de

las reivindicaciones 11 a 13 para usar el tratamiento o la reducción de la incidencia de anemia.

20. El polipéptido o el polinucleótidos para el uso de acuerdo a la reivindicación 19, en donde la secuencia de al menos una terminal carboxilo de gonadotropina coriónica se compone de una secuencia de aminoácido seleccionada desde las secuencias previstas en Nº ID SEC: 17-18.

FIGURAS 1 A-F

FIGURA 2

FIGURA 3

FIGURA 4

FIGURA 5

FIGURA 6

FIGURA 7

FIGURA 8

FIGURA 9

FIGURA 10

FIGURA 11