MEZCLAS DE OLIGOSACÁRIDOS DERIVADOS DE HEPARINA, SU PREPARACIÓN Y LAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE LOS CONTIENEN.

Mezclas de oligosacáridos que poseen la estructura general de los polisacáridos que constituyen la heparina y que presentan las características siguientes:

un peso molecular medio de 1.800 a 2.400 Daltons, determinado por cromatografía líquida de alta presión utilizando dos columnas en serie, una actividad anti-Xa comprendida entre 190 UI/mg y 450 UI/mg, medida respecto a una heparina de muy bajo peso molecular estándar que titula de 140 a 180 U/mg, una actividad anti-IIa inferior a 0,2 UI/mg, medida por el método amidolítico sobre un sustrato cromogénico según el método descrito en la monografía de las heparinas de baja masa molecular de la farmacopea europea, entendiéndose que los oligosacáridos que constituyen las mezclas contienen de 2 a 16 restos sacarídicos, tienen un resto ácido urónico-4,5 insaturado 2-O-sulfato en uno de sus extremos, y contienen el hexasacárido de fórmula siguiente: en forma de una sal de metal alcalino o alcalinotérreo

La presente invención se refiere a mezclas de oligosacáridos derivados de la heparina que tienen un peso molecular medio de 1.800 a 2.400 Daltons, caracterizados por una fuerte actividad anti-Xa (aXa) y una ausencia de actividad anti-IIa (aIIa), a su procedimiento de preparación y a las composiciones farmacéuticas que los contienen.

La heparina es una mezcla de mucopolisacáridos sulfatados de origen animal, utilizada principalmente por sus 5 propiedades anticoagulantes y antitrombóticas.

La heparina presenta sin embargo inconvenientes que limitan las condiciones de su utilización. En particular, su actividad anticoagulante importante (aIIa) puede ocasionar hemorragias. (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol 5 sup. 3 (1999)).

Las heparinas de bajo peso molecular, obtenidas principalmente por despolimerización básica de ésteres de heparina y 10 actualmente comercializadas tal como Enoxaparina, presentan igualmente una actividad aIIa importante

Más recientemente, las heparinas de muy bajo peso molecular se han descrito en la técnica anterior. Por ejemplo, en la patente US 6.384.021 los productos presentan una actividad anti-Xa comprendida entre 100 y 120 UI/mg, una actividad anti-IIa comprendida entre 2 y 8 UI/mg. En las solicitudes internacionales WO02/08295 y WO2004/033503 los productos presentan actividades anti-Xa comprendidas principalmente entre 100 y 190 UI/mg para las actividades anti-IIa inferiores 15 a 5 UI/mg. Sin embargo, ninguna de estas heparinas de muy bajo peso molecular presentan efectivamente una actividad anti-Xa superior a 190 UI/mg presentando una actividad anti-IIa nula o prácticamente nula. (UI = Unidad Internacional)

Por actividad anti-IIa prácticamente nula (o dicho de otra manera, que no presenta prácticamente actividad anti-IIa) se entiende, una actividad inferior a 0,2 UI/mg. 20

La invención tiene por objeto las mezclas de oligosacáridos que poseen una actividad muy selectiva frente al factor X activado (factor Xa) sin presentar, o prácticamente sin presentar, actividad anti-IIa.

La presente invención tiene por lo tanto por objeto las mezclas de oligosacáridos que poseen la estructura general de los polisacáridos constitutivos de la heparina y que presentan las características siguientes:

 tienen un peso molecular medio de 1.800 a 2.400 Daltons, una actividad anti-Xa comprendida entre 190 25 UI/mg y 450 UI/mg y una actividad anti-IIa inferior a 0,2 UI/mg.

 los oligosacáridos constitutivos de las mezclas

 contienen de 2 a 16 restos sacarídicos,

 tienen un resto ácido urónico-4,5 insaturado 2-O-sulfato en uno de sus extremos,

 y contienen el hexasacárido de fórmula siguiente: 30

en forma de una sal de metal alcalino o alcalinotérreo.

El hexasacárido ΔIIa-IIs-Is contenido en la mezcla de oligosacáridos descrita en la presente invención es una secuencia fuertemente afín a ATIII y se caracteriza por una actividad aXa superior a 740 UI/mg.

Como sal de metal alcalino o alcalinotérreo, se prefieren las sales de sodio, potasio, calcio y magnesio. 35

El peso molecular medio se determina por cromatografía líquida de alta presión utilizando dos columnas en serie, por ejemplo, las comercializadas con el nombre de TSK G3000 XL y TSK G2000 XL. La detección se realiza por refractometría. El eluyente utilizado es nitrato de litio y el caudal es 0,6 ml/min. El sistema se calibra con estándares preparados por fraccionamiento de la Enoxaparina por cromatografía en gel de agarosa-poliacrilamida (IBF). Esta preparación se realiza según la técnica descrita por Barrowcliffe et al, Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) o D.A. Lane et 5 al, Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78). Los resultados se calculan mediante el programa informático GPC6 (Perkin Elmer). La actividad anti-Xa se mide por el método amidolítico sobre un sustrato cromogénico según el principio descrito por Teien et al, Thromb. Res., 10, 399-410 (1977). Las dosificaciones se realizan según el método descrito en la monografía de las heparinas de baja masa molecular de la farmacopea europea en vigor, con la excepción del tampón de reconstitución: la albúmina del tampón Tris-NaCl pH 7,4 se reemplaza por Polietilen Glicol 6000 (PEG 6000). 10

La medida de la actividad anti-Xa se realiza respecto a una heparina de muy bajo peso molecular (HTBPM) estándar que se titula de 140 a 180 U/mg (sobre seco). La actividad de la HTBPM estándar se mide respecto al patrón internacional estándar de la heparina de bajo peso molecular.

Esta HTBPM estándar se preparó según la enseñanza de las solicitudes de patente WO WO02/08295 y principalmente de WO2004/033503. La actividad de la HTBPM estándar se mide respecto al patrón internacional estándar de la 15 heparina de bajo peso molecular.

La actividad anti-IIa se mide por el método amidolítico sobre un sustrato cromogénico según el método descrito en la monografía de las heparinas de baja masa molecular de la farmacopea europea en vigor. La medida de las actividades aIIa se realiza respecto a una heparina de muy bajo peso molecular (HTBPM) estándar con actividad medida 2,1 UI/mg. La actividad de HTBPM estándar se mide respecto al patrón internacional estándar de la heparina de bajo peso 20 molecular.

Según un modo preferido, la mezcla de oligosacáridos según la invención contiene de 20 a 100% de una fracción hexasacárida. En particular, esta mezcla contiene de 30 a 60% de fracción hexasacárida.

Por otra parte, las mezclas según la invención contienen de 20 a 70% del hexasacárido ΔIIa-IIs-Is en la fracción hexasacárida de la mezcla de oligosacáridos. En particular, esta fracción ΔIIa-ns-Is está presente en la fracción 25 hexasacárida a nivel de 25 a 50%.

El porcentaje de la fracción hexasacárida puede determinarse de forma analítica por cromatografía líquida de alta presión en columnas TSK G3000 XL y TSK G2000 XL o bien por separación preparativa de la fracción hexasacárida.

La mezcla en este caso se cromatografía en columnas rellenas de gel de tipo poliacrilamida agarosa. La mezcla se eluye con una disolución de hidrógenocarbonato de sodio. Preferentemente, la disolución de hidrógenocarbonato de 30 sodio es una disolución de 0,1 moles/ 1 a 1 mol/l. Aún más preferentemente, la separación se realiza a una concentración de 1 mol/l. La detección se realiza por espectrometría UV (254nm). Después del fraccionamiento, la fracción hexasacárida en disolución en hidrógenocarbonato de sodio se neutraliza con ácido acético glacial. La disolución se concentra bajo presión reducida de forma que se obtiene una concentración de acetato de sodio superior a 30% en peso. La fracción de hexasacárido se precipita por adición de 3 a 5 volúmenes de metanol. La fracción de 35 hexasacáridos se recupera por filtración sobre vidrio sinterizado n°3. La mezcla de hexasacáridos obtenida puede analizarse por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) para determinar el contenido en hexasacárido ΔIIa-IIs-Is. El hexasacárido ΔIIa-IIs-Is puede aislarse por cromatografía HPLC preparativa o por cromatografía de afinidad en columna antitrombina III sefarosa según las técnicas utilizadas por el experto en la técnica (M. Hook, I. Bjork, J. Hopwood y U. Lindahl, F.E B.S letters, vol 656(1) (1976)). 40

Preferentemente, las mezclas según la invención tienen un peso molecular medio comprendido entre 1.900 y 2.200 Daltons y en particular de 1.950 a 2.150 Daltons.

Según un modo preferido, la mezcla de oligosacáridos según la invención se caracteriza porque presenta una actividad anti-Xa comprendida entre 190 UI/mg y 410 UI/mg y una actividad anti-IIa nula o prácticamente nula. Muy particularmente, la actividad anti-Xa está comprendida entre 200 y 300 UI. 45

La invención tiene por lo tanto muy particularmente por objeto las mezclas que presentan las características siguientes:

 un peso molecular medio comprendido entre 1.950 y 2.150 Daltons.

 una actividad anti-Xa comprendida entre 190 UI/mg y 410 UI/mg y una actividad anti-IIa inferior a 0,2 UI/mg.

 contienen de 30 a 60% de fracción hexasacárida que contiene de 25 a 55% de fracción ΔIIa-IIs-Is....

1. Mezclas de oligosacáridos que poseen la estructura general de los polisacáridos que constituyen la heparina y que presentan las características siguientes:

 un peso molecular medio de 1.800 a 2.400 Daltons, determinado por cromatografía líquida de alta presión utilizando dos columnas en serie, 5

 una actividad anti-Xa comprendida entre 190 UI/mg y 450 UI/mg, medida respecto a una heparina de muy bajo peso molecular estándar que titula de 140 a 180 U/mg,

 una actividad anti-IIa inferior a 0,2 UI/mg, medida por el método amidolítico sobre un sustrato cromogénico según el método descrito en la monografía de las heparinas de baja masa molecular de la farmacopea europea,

 entendiéndose que los oligosacáridos que constituyen las mezclas 10

 contienen de 2 a 16 restos sacarídicos,

 tienen un resto ácido urónico-4,5 insaturado 2-O-sulfato en uno de sus extremos,

 y contienen el hexasacárido de fórmula siguiente:

en forma de una sal de metal alcalino o alcalinotérreo. 15

2. Mezclas de oligosacáridos según la reivindicación 1 caracterizadas porque las sales de metal alcalino o alcalinotérreo son las sales de sodio, potasio, calcio y magnesio.

3. Mezclas de oligosacáridos según la reivindicación 1 ó 2 caracterizadas porque contienen de 20 a 100%, y en particular de 30 a 60%, de fracción hexasacárida.

4. Mezclas de oligosacáridos según la reivindicación 3 caracterizadas porque la fracción hexasacárida contiene de 20 20 a 70%, y en particular de 25 a 50%, del hexasacárido ΔIIa-IIs-Is tal como se ha definido en la reivindicación 1.

5. Mezclas de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizadas porque tienen un peso molecular medio comprendido entre 1.900 y 2.200 y en particular de 1.950 a 2.150 Daltons.

6. Mezclas de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizadas porque tienen una actividad anti-Xa comprendida entre 190 UI/mg y 410 UI/mg, y en particular entre 200 y 300 UI/mg, presentando una 25 actividad anti-IIa inferior a 0,2 UI/mg.

7. Mezclas de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizadas porque presentan las características siguientes:

 un peso molecular medio comprendido entre 1.950 y 2.150 Daltons,

 una actividad anti-Xa comprendida entre 190 UI/mg y 410 UI/mg y una actividad anti-IIa inferior a 0,2 30 UI/mg,

 contienen de 30 a 60% de fracción hexasacárida que contiene de 25 a 55% de fracción ΔIIa-IIs-Is.

8. Procedimiento de preparación de las mezclas de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque una heparina de muy bajo peso molecular que tiene:

una actividad anti-Xa superior a 140 UI/mg, medida respecto a una heparina de muy bajo peso molecular estándar que titula de 140 a 180 U/mg,

una actividad anti-IIa inferior a 5 UI/mg, medida por el método amidolítico sobre un sustrato cromogénico según el método descrito en la monografía de las heparinas de baja masa molecular de la farmacopea europea, y

una masa molecular media comprendida entre 2.000 y 3.000 Daltons, determinada por cromatografía líquida de 5 alta presión utilizando dos columnas en serie,

se somete a las reacciones químicas siguientes:

a) Transalificación por acción de cloruro de bencetonio para obtener el heparinato de bencetonio,

b) Esterificación del heparinato de bencetonio obtenido por acción de cloruro de bencilo, y tratamiento con una disolución alcohólica de acetato de sodio para obtener la sal de sodio del éster bencílico de la heparina de muy bajo 10 peso molecular

c) Transalificación del éster bencílico obtenido y obtención de la sal de amonio cuaternario,

d) Despolimerización mediante una base orgánica fuerte con pka preferentemente superior a 20 con el fin de obtener una heparina de muy bajo peso molecular despolimerizada,

e) Transformación de la sal de amonio cuaternario de la heparina de muy bajo peso molecular despolimerizada en 15 sal de sodio

f) Saponificación de los ésteres residuales y opcionalmente purificación.

9. Procedimiento de preparación según la reivindicación 8 caracterizado porque la relación en mol base fuerte/éster utilizada durante la etapa de polimerización d) está comprendida entre 0,2 y 5 y, preferentemente, entre 0,6 y 2.

10. Procedimiento de preparación según la reivindicación 8 ó 9 caracterizado porque la etapa de despolimerización d) 20 se efectúa utilizando como base un derivado del fosfaceno.

11. Procedimiento de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 caracterizado porque la etapa de despolimerización d) se efectúa con contenidos en agua inferiores a 0,3% cuando se opera con 1 equivalente molar de base fosfaceno respecto al éster bencílico de la heparina de muy bajo peso molecular, sal de bencetonio.

12. Procedimiento de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 caracterizado porque las bases 25 de la familia de los fosfacenos utilizadas durante la etapa de despolimerización d) son, preferentemente, las de fórmula:

en la que los radicales R1 a R7, idénticos o diferentes, representan radicales alquilos lineales, ramificados o cíclicos que contienen de 1 a 6 átomos de carbono pudiendo formar R3 y R4, llegado el caso, con el grupo al que están unidos -N-P-N- un heterociclo de 6 eslabones. 30

13. Procedimiento de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 caracterizado porque la base de la familia de los fosfacenos utilizada durante la etapa de despolimerización es 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilperhidro-1,3,2-diaza-fosforina.

14. Procedimiento de preparación según la reivindicación 8 caracterizado porque la tasa de esterificación de la sal de amonio cuaternario del éster bencílico de la heparina durante la etapa b) está comprendida entre 40 y 100% y, 35 preferentemente, entre 70 y 90%.

15. Procedimiento de preparación según la reivindicación 8 caracterizado porque la transformación de la sal de amonio cuaternario del éster bencílico de la heparina de muy bajo peso molecular tal como se ha preparado según la etapa b) del procedimiento según la reivindicación 8 en sal de sodio se efectúa por tratamiento del medio de reacción con una disolución alcohólica de acetato de sodio al 10% de acetato de sodio en metanol (peso/volumen), a una temperatura 40 comprendida entre 15 y 25°C.

16. Procedimiento de preparación según la reivindicación 15 caracterizado porque el equivalente en peso de acetato de sodio añadido durante la etapa de esterificación b) es 3 veces superior a la masa de sal de amonio cuaternario del éster bencílico de la heparina aplicada en la reacción de despolimerización.

17. Procedimiento de preparación según la reivindicación 8 de las mezclas de oligosacáridos caracterizado porque la sal de amonio cuaternario del éster bencílico de la heparina de muy bajo peso molecular obtenida durante la etapa c) es preferentemente la sal de bencetonio, de cetilpiridinio o de cetiltrimetil amonio.

18. Procedimiento de preparación según la reivindicación 8 caracterizado porque la saponificación (según la etapa f) se efectúa mediante un hidróxido de metal alcalino tal como sosa, potasa, hidróxido de litio, en medio acuoso, a una 5 temperatura comprendida entre 0 y 20°C y preferentemente 0 y 10°C.

19. Procedimiento de preparación según la reivindicación 18 caracterizado porque se utiliza de 1 a 5 equivalentes molares del hidróxido de metal alcalino y más particularmente de 1 a 2 equivalentes molares del hidróxido de metal alcalino.

20. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 19, de preparación de mezclas de oligosacáridos 10 tales como se han descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que poseen una selectividad frente al factor Xa aumentada caracterizado porque además se eliminan las fracciones disacáridas y tetrasacáridas por cromatografía principalmente en columnas rellenas con gel de tipo poliacrilamida agarosa.

21. Procedimiento de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20 de las mezclas de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque se utiliza como producto de partida una 15 heparina de bajo peso molecular, o una heparina de muy bajo peso molecular (1.500 a 3.000 Da) que tiene una actividad anti-Xa comprendida entre 100 y 140 UI/mg en lugar de la heparina de muy bajo peso molecular tal como se ha definido en la reivindicación 8.

22. Procedimiento de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20 de las mezclas de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque se utiliza a título de producto de partida una 20 heparina de muy bajo peso molecular (1.500 a 4.000 Da) que tiene una actividad anti-Xa comprendida entre 100 y 140 UI/mg en lugar de la heparina de muy bajo peso molecular tal como se ha definido en la reivindicación 8.

23. Procedimiento de preparación según la reivindicación 21 caracterizado porque la heparina de bajo peso molecular se elige entre Enoxaparina, Fraxiparina, Fragmina, Innohep (o Logiparina), Normiflo, Embollex (o Sandoparina), Fluxum (o Minidalton), Clivarina e Hibor. 25

24. Medicamento, caracterizado porque comprende una mezcla de oligosacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

25. Medicamento según la reivindicación 24 para el tratamiento o la prevención de trombosis venosas y arteriales, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, angina inestable, infarto de miocardio, isquemia cardiaca, enfermedades oclusivas de las arterias periféricas y fibrilación auricular, proliferación de las células musculares lisas aterosclerosis y 30 arteriosclerosis, cáncer por la modulación de la angiogénesis y los factores de crecimiento, así como trastornos diabéticos tales como retinopatías y nefropatías diabéticas.

26. Composición farmacéutica que contiene al menos un medicamento tal como se ha definido en la reivindicación 24 y uno o varios excipientes o vehículos o aditivos farmacéuticamente inertes.

27. Composición farmacéutica según la reivindicación 26 caracterizada porque consiste en una disolución inyectable 35 por vía subcutánea o intravenosa.

28. Composición farmacéutica según la reivindicación 26 caracterizada porque consiste en una formulación por inhalación destinada a la vía pulmonar.

29. Composición farmacéutica según la reivindicación 26 caracterizada porque consiste en una formulación destinada a la vía oral. 40