Método para la extracción de gluten nativo e hidrolizado.La presente invención se refiere a una composición y un método para la extracción de gluten de alimentos.

La presente invención permite la extracción de gluten de alimentos que han sido sometidos a diferentes tratamientos térmicos y/o hidrolíticos y en los que las proteínas que componen el gluten pueden estar hidrolizadas y su estructura modificada. La extracción de gluten mediante esta invención es compatible con sistemas de enzimoinmunoensayo para la cuantificación de gluten como el ELISA Competitivo, así como con otras técnicas empleadas en el análisis de gluten

Método para la extracción de gluten nativo e hidrolizado.

La presente invención se refiere a una composición y un método para la extracción de gluten de alimentos. La presente invención permite la extracción de gluten de alimentos que han sido sometidos a diferentes tratamientos térmicos y/o hidrolíticos y en los que las proteínas que componen el gluten pueden estar hidrolizadas y su estructura modificada. La extracción de gluten mediante esta invención es compatible con sistemas de enzimoinmunoensayo para la cuantificación de gluten como el ELISA Competitivo, así como con otras técnicas empleadas en el análisis de gluten.

Estado de la técnica anterior

La enfermedad celíaca es una intolerancia permanente al gluten de trigo, cebada, centeno y posiblemente también de la avena. La ingesta de dichas proteínas induce, en personas genéticamente predispuestas, una lesión severa de la mucosa intestinal, que se caracteriza histológicamente por una hiperplasia de criptas con atrofia total o subtotal de las vellosidades intestinales. La enfermedad celíaca tiene una incidencia aproximada de 1:100-200 habitantes, aunque existen diferencias geográficas importantes (1:100-1:500) que no siempre pueden adscribirse a diferencias genéticas o ambientales.

El gluten es una mezcla de proteínas de almacenamiento de los granos de cereales que forman una red cuando la harina se hidrata y se mezcla. Esta red se debe principalmente a la asociación de prolaminas (denominadas gliadinas en el trigo, hordeínas en la cebada y secalinas en el centeno) y glutelinas (gluteninas para el trigo, y sus homologas para cebada y centeno) a través de enlaces no covalentes.

El único tratamiento posible para los pacientes celíacos es el seguimiento de una dieta estrictamente exenta de gluten de por vida, lo cual implica la ingesta exclusiva de alimentos sin gluten. De ahí la importancia de realizar una correcta cuantificación del contenido en gluten de los alimentos.

Teniendo en cuenta los datos científicos y clínicos disponibles sobre la cantidad de gluten que pueden tolerar los pacientes celíacos y basado en las recomendaciones del Codex Alimentarius (ALINORM 08/31/26), recientemente se ha publicado un Reglamento sobre la composición y etiquetado de productos alimenticios apropiados para personas con intolerancia al gluten (REGLAMENTO CE No 41/2009) aplicable a todos los estados miembros de la Unión Europea y en el que se establece que los productos alimenticios pueden llevar en su etiquetado el término "exentos de gluten" si el contenido de gluten no sobrepasa los 20 mg/kg en total, medido en los alimentos tal como se venden al consumidor final. Asimismo, aquellos productos alimenticios etiquetados con la mención "contenido muy reducido de gluten" no contendrán un nivel de gluten que supere los 100 mg/kg en los alimentos tal como se venden al consumidor final.

Por ello, y para asegurar el cumplimiento de dicho Reglamento, es esencial que las técnicas analíticas disponibles para la extracción y cuantificación de gluten sean lo más exactas y precisas posibles.

En la actualidad la técnica empleada de referencia para el análisis de gluten en alimentos es el ELISA R5 Sándwich que está basado en el empleo de un único anticuerpo monoclonal R5 y permite la detección de manera simultánea de gluten de trigo, cebada y centeno con un límite de cuantificación de 3 ppm de gluten. Este ELISA representa un sistema específico, de gran fiabilidad y altamente sensible para la detección de gluten de trigo, cebada y centeno en alimentos para celíacos.

El anticuerpo R5 reconoce específicamente el epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos QQPFP, y algunas relacionadas presentes en una serie de secuencias descritas como potencialmente tóxicas para los celíacos y que están muy repetidas en todas las fracciones de gliadinas, hordeínas y secalinas. Además, este sistema es capaz de detectar el péptido 33 mer y otros cuya implicación en la patogénesis de la enfermedad celíaca ha sido demostrada.

Este ELISA R5 Sándwich ha sido sometido a un proceso de validación internacional en el que han participado 20 laboratorios europeos y, además, en 2006 la Comisión del Codex Alimentarius de la Organización para la Agricultura y la Alimentación de la ONU (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha aprobado con nivel I el método ELISA R5 Sándwich, desarrollado en la Unidad de Gluten, como método capaz de cuantificar el gluten de los alimentos.

Actualmente existen en el mercado varios Kits comerciales de ELISA R5 y tiras inmunocromatográficas basados en el anticuerpo R5, que permiten detectar con garantía la presencia de gluten y se comercializan en un gran número de países de todo el mundo.

El ELISA-R5 Sándwich se complementa con un "Cocktail de extracción" (solicitud de patente WO 02/092633 A1) que viene a solventar el problema de extraer el gluten en los alimentos en cuya elaboración existe un tratamiento térmico. Dicho "Cocktail de extracción" solubiliza aquellos agregados insolubles de las fracciones tóxicas del gluten que se han formado por el calor, favoreciendo su solubilidad y permitiendo de esta manera que puedan ser extraídos y cuantificados por el ELISA R5 Sándwich.

No obstante, hay que tener en cuenta que los ingredientes de los alimentos son muy complejos y en el proceso de elaboración pueden verse sometidos a diferentes tratamientos que modifiquen y/o hidrolicen las proteínas. Así, una de las limitaciones del ELISA R5 Sándwich es la imposibilidad de medir correctamente las prolaminas hidrolizadas, debido a que en esta técnica se necesitan al menos dos epítopos (QQPFP) y cuando las proteínas se encuentran hidrolizadas pueden no estar presentes los dos epítopos necesarios. Para solventar este problema se ha desarrollado un sistema también basado en el anticuerpo monoclonal R5, el ELISA R5 Competitivo (solicitud de patente WO 06/051145 A1), que es capaz de medir tanto prolaminas hidrolizadas presentes en alimentos hidrolizados como los siropes y las cervezas, así como las prolaminas intactas, con un límite de cuantificación de 3 ppm de gluten. Así, el sistema de ELISA R5 Competitivo presenta la ventaja respecto al ELISA R5 Sándwich de permitir cuantificar incluso fragmentos de proteínas que sólo contienen un epítopo intacto.

El proceso de extracción es un factor de gran importancia en el análisis de gluten por los sistemas de ELISA R5, tanto Competitivo como Sándwich. Esto es debido en primer lugar a que debe obtenerse un rendimiento lo más cercano posible al 100% para que los resultados sean exactos, y que la cantidad de gluten extraído sea total para garantizar que los alimentos etiquetados como "sin gluten" realmente presentan un contenido en gluten por debajo del límite fijado como máximo permitido.

Hasta ahora, para el sistema de ELISA R5 Competitivo, que como se ha expuesto es el único capaz de cuantificar el gluten presente tanto de forma intacta como hidrolizada, se ha utilizado como sistema de extracción etanol 60% (v/v), ya que el "cocktail de extracción" no es compatible con el sistema de ELISA Competitivo debido a que, en las condiciones en que se lleva a cabo la reacción, los agentes reductores contenidos en el "cocktail de extracción" destruyen el anticuerpo R5 conjugado del ELISA dando lugar a valores muy altos que son irreales y se pueden considerar como falsos positivos o artefactos.

Además, dada la complejidad de los alimentos y la posibilidad de que puedan darse falsos positivos o negativos en los resultados de los análisis, se han desarrollado una serie de técnicas complementarias como el Western blot R5 y los métodos basados en la espectrometría de masas que permiten confirmar los resultados obtenidos mediante el sistema de ELISA R5 y ofrecer datos de análisis muy fiables que garanticen un consumo seguro por parte de la población celíaca. En este sentido y posterior al desarrollo del "cocktail de extracción", se realizaron modificaciones en el mismo para conseguir que el sistema fuese compatible con la técnica Western blot (Patente WO 07/104825 A1). Así, aún cuando se consiguió que dicho sistema sea compatible, para obtener buenos resultados en muestras con bajo contenido en gluten es necesario llevar a cabo una serie de procesos que permitan eliminar el exceso de sales que pueden dificultar que se realice correctamente el proceso se electroforesis que se lleva a cabo en la técnica de Western blot, lo cual hace el análisis más largo y se pueden perder proteínas de interés en los pasos que se realizan... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende:

y que se encuentra a un pH de entre 7 y 8.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que la tris(2-carboxietil)fosfina o su sal se encuentra a una concentración de entre 2 mM y 5 mM.

3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la N-Lauroilsarcosina o su sal se encuentra en una proporción de entre el 1% y el 6% peso/volumen.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el tampón se selecciona de la lista que comprende: Tris-Clorhídrico o PBS.

5. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la extracción de gluten de una muestra.

6. Uso según la reivindicación 5, donde la muestra es un alimento.

7. Preparación combinada para su uso en la extracción de gluten de una muestra que comprende:

8. Preparación combinada para su uso en la extracción de gluten de una muestra según la reivindicación 7, en la que la tris(2-carboxietil)fosfina o su sal se encuentra a una concentración de entre 2 mM y 5 mM.

9. Preparación combinada para su uso en la extracción de gluten de una muestra según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en la que la N-Lauroilsarcosina o su sal se encuentra en una proporción de entre el 1% y el 6% volumen/volumen.

10. Preparación combinada para su uso en la extracción de gluten de una muestra según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde el tampón se selecciona de la lista que comprende: Tris-Clorhídrico y PBS.

11. Preparación combinada para su uso en la extracción de gluten de una muestra según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde la muestra es un alimento.

12. Método de extracción de gluten de una muestra que comprende:

13. Método de extracción de gluten de una muestra según la reivindicación 12, donde en el paso (a) la relación de peso:volumen muestra:composición es de entre 1:5 y 1:20.

14. Método de extracción de gluten de una muestra según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde en el paso (b) se incuba a una temperatura de entre 18 y 25ºC durante un periodo de tiempo de entre 40 min y 90 min.

15. Método de extracción de gluten de una muestra según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde en el paso (b) se incuba a una temperatura de entre 40 y 60ºC durante un periodo de tiempo de entre 10 min y 50 min.

16. Método de extracción de gluten de una muestra según la reivindicación 12, donde entre el paso (b) y el paso (c) comprende un paso adicional en el que el producto resultante del paso (b) se enfría a una temperatura de entre 18ºC y 25ºC.

17. Método de extracción de gluten de una muestra según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, donde el etanol se encuentra en una proporción de entre el 40% y el 70% del volumen total del producto resultante del paso (c) del método de la invención.

18. Método de extracción de gluten de una muestra según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, donde en el paso (d) se incuba a una temperatura de entre 18ºC y 25ºC durante un periodo de tiempo de entre 30 min y 70 min.

19. Método de extracción de gluten de una muestra según la reivindicaciones 12 a 18, donde la separación del paso (e) comprende la centrifugación de la muestra.

20. Método de extracción de gluten de una muestra según la reivindicación 19 donde la centrifugación de la muestra se realiza a una velocidad de giro de entre 2000 y 4000 g durante un periodo de tiempo de entre 5 min y 20 min.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, donde la muestra es un alimento.

22. Kit para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21 que comprende: