Método de diagnóstico de accidente cerebrovascular o la posibilidad del mismo en un sujeto del que se sospecha que padece de accidente cerebrovascular,

que comprende determinar la concentración de Apo C-III en una muestra de líquido corporal extraída del sujeto

Método para distinguir entre accidente cerebrovascular isquémico y hemorrágico.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a un método de diagnóstico de accidente cerebrovascular.

El accidente cerebrovascular tiene la tercera tasa de mortalidad más alta en los países industriales. Está provocado o bien por una hemorragia en el cerebro de un vaso sanguíneo roto (accidente cerebrovascular hemorrágico) o bien por una obstrucción de un vaso sanguíneo en el cerebro (accidente cerebrovascular trombótico o isquémico). El accidente cerebrovascular resulta de una reducción o bien permanente o bien transitoria del flujo sanguíneo cerebral. En la mayoría de los casos, esta reducción de flujo está provocada por la oclusión arterial debido a o bien un émbolo o bien una trombosis local. Dependiendo de la ubicación de la lesión cerebral y la intensidad de neuronas necrosadas, los síntomas del accidente cerebrovascular pueden convertirse en una minusvalía de por vida para los pacientes y la tasa de mortalidad debida a acontecimientos de accidentes cerebrovasculares se aproxima al 30%.

Recientemente, se describió S100B como un marcador bioquímico potencial para el diagnóstico de accidente cerebrovascular, véase U. Missler et al., "S100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarct volume and prognosis in acute ischemia stroke", Stroke 1997; 28: 1956-60. Sin embargo, también se ha notificado S100B como un marcador útil para la detección temprana de metástasis de melanoma y complicaciones cerebrales debidas a una lesión en la cabeza y cirugía cardiaca. Por tanto, la sensibilidad y la especificidad de la prueba de S100B se limitaron al 44% y al 67%, respectivamente, véase M. Takahashi et al., "Rapid and sensitive inmunoassay for the measurement of serum S100B using isoform-specific monoclonal antibody", Clin. Chem. 1999; 45: 1307-11. El desarrollo de nuevos marcadores de accidente cerebrovascular ayudará a los médicos a establecer un diagnóstico temprano.

El documento WO 01/42793 se refiere a un ensayo de diagnóstico para accidente cerebrovascular en el que se determina la concentración de proteína de unión a ácidos grasos de corazón o cerebro (H-FABP o B-FABP) en una muestra de líquido corporal.

El documento US-A-6225047 describe el uso de cromatografía de retención para generar mapas de diferencia, y en particular un método de identificación de analitos que están presentes diferencialmente entre dos muestras. Un método específico descrito en el mismo es la espectrometría de masas con desorción por láser.

El documento WO 01/25791 describe un método para ayudar a un diagnóstico de cáncer de próstata, que comprende determinar una cantidad de prueba de un marcador polipeptídico, que está presente diferencialmente en muestras de un paciente con cáncer de próstata y un sujeto que no tiene cáncer de próstata. El marcador puede determinarse usando espectrometría de masas, y preferiblemente espectrometría de masas con desorción por láser.

Altes et al, Acta Haematologica, vol. 94, n.º 1, 1995, páginas 10-15, se refieren a la identificación de patrones anómalos de coagulación en accidente cerebrovascular isquémico establecido. Se tratan niveles de antitrombina III.

Kawamoto et al, Japanese Journal of Geriatrics 1985, vol. 22, n.º 6, 1985, páginas 550-557, en su resumen en inglés, se refieren a factores de riesgo para cardiopatía isquémica y trombosis cerebral. Entre los factores de riesgo mencionados están diversas lipoproteínas séricas, incluyendo Apo C-III.

El documento WO 01/64008 se refiere a terapias con vacunas para enfermedades ateroscleróticas, y da a conocer un inmunógeno que comprende una apolipoproteína, preferiblemente Apo C-III.

El documento US 4801531 se refiere a polimorfismos de Apo A-I y C-III que son predictivos de aterosclerosis.

El documento WO 96/00903 da a conocer anticuerpos monoclonales dirigidos frente a diversas apolipoproteínas, incluyendo Apo C-III, inmovilizados en materiales en fase sólida.

El documento WO 01/71360 se refiere a marcadores para cáncer de próstata.

El desarrollo de nuevos marcadores de accidente cerebrovascular no invasivos para líquidos corporales y nuevos métodos de determinación de los marcadores ayudará a los médicos a establecer un diagnóstico temprano. Ahora la presente invención ha solucionado este problema.

Nuestra solicitud anterior PCT/EP03/01462 (documento WO 03/069346) da a conocer un método de diagnóstico de accidente cerebrovascular o la posibilidad del mismo en un sujeto del que se sospecha que padece de accidente cerebrovascular, que comprende someter una muestra de líquido corporal extraída del sujeto a espectrometría de masas, para determinar de ese modo una cantidad de prueba de un polipéptido en la muestra, en el que el polipéptido está contenido diferencialmente en el líquido corporal de sujetos afectados por accidente cerebrovascular y sujetos no afectados por accidente cerebrovascular, y tiene un peso molecular en el intervalo de desde 3000 hasta 30000; y determinar si la cantidad de prueba concuerda con un diagnóstico de accidente cerebrovascular. En una realización preferida la espectrometría de masas implica desorción/ionización por láser mejorada en superficie (SELDI).

Sumario de la invención

Se han investigado adicionalmente los picos de espectrometría de masas (SELDI) en nuestra solicitud anterior, mediante los procedimientos descritos en los ejemplos 4-9 a continuación, que se refieren a la identificación e inmunovalidación de marcadores de accidente cerebrovascular. Como resultado, se ha encontrado que ciertos polipéptidos son marcadores útiles en el diagnóstico de accidente cerebrovascular y daño cerebral.

El nuevo marcador Apo C-III usado en la presente invención y otros marcadores que se han encontrado son tal como sigue:

Apolipoproteína C-III (denominada a continuación en el presente documento Apo C-III). Ésta es una candidata para el pico de SELDI de 11,7 kDa (como forma glicosilada). Tiene el número de registro de Swiss-Prot P02656, una longitud de 79 aa, un peso molecular de 8765 Da y la siguiente secuencia:

Proteína amiloide A sérica (SAA). Ésta es una proteína candidata para los picos de SELDI por SAX2 de 11,5 y 11,7 kDa. Tiene el número de registro de Swiss-Prot P02735, una longitud de 103 aa, un peso molecular de 11682 Da y la siguiente secuencia:

Apolipoproteína C-I (denominada a continuación en el presente documento Apo C-I). Ésta es una proteína candidata para los picos de SELDI por SAX2 de 6,44 y 6,64 kDa. Tiene el número de registro de Swiss-Prot P02654, una longitud de 57 aa, un peso molecular de 6631 Da y la siguiente secuencia:

Antitrombina III (fragmento). Ésta es una proteína candidata para los picos de SELDI por SAX2 de 4,47, 4,63 y 4,80. Tiene el número de registro de Swiss-Prot P01008, una longitud de 38 aa, un peso molecular de 4473 Da y la siguiente secuencia:

Apolipoproteína A-I (denominada a continuación en el presente documento Apo A-I). Ésta es una proteína candidata para el pico de SELDI por SAX2 de 28 kDa. Tiene el número de registro de Swiss-Prot P02647, una longitud de 244 aa, un peso molecular de 28079 Da y la siguiente secuencia:

La presente invención proporciona un método de diagnóstico de accidente cerebrovascular o la posibilidad del mismo en un sujeto del que se sospecha que padece de accidente cerebrovascular, que comprende determinar la concentración de Apo C-III en una muestra de líquido corporal extraída del sujeto. Otros aspectos de la invención se definen...

1. Método de diagnóstico de accidente cerebrovascular o la posibilidad del mismo en un sujeto del que se sospecha que padece de accidente cerebrovascular, que comprende determinar la concentración de Apo C-III en una muestra de líquido corporal extraída del sujeto.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la Apo C-III está contenida diferencialmente en el líquido corporal de sujetos afectados por accidente cerebrovascular y sujetos no afectados por accidente cerebrovascular, y el método incluye determinar si la concentración de Apo C-III en la muestra concuerda con un diagnóstico de accidente cerebrovascular.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que se usa un anticuerpo frente a la Apo C-III en la determinación de la concentración.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el líquido corporal es líquido cefalorraquídeo, plasma, suero, sangre, lágrimas u orina.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la determinación de la concentración de la Apo C-III se usa para determinar si un accidente cerebrovascular diagnosticado es del tipo isquémico o hemorrágico.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende someter una muestra de líquido corporal extraída del sujeto a espectrometría de masas, para determinar de ese modo una cantidad de prueba de la Apo C-III en la muestra, en la que la Apo C-III está contenida diferencialmente en el líquido corporal de sujetos afectados por accidente cerebrovascular y sujetos no afectados por accidente cerebrovascular; y determinar si la cantidad de prueba concuerda con un diagnóstico de accidente cerebrovascular.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la espectrometría de masas es espectrometría de masas con desorción/ionización por láser.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en el que se adsorbe la muestra en una sonda que tiene una superficie de intercambio catiónico débil o aniónico fuerte, hidrófoba, de captura por afinidad con metales inmovilizados (IMAC) que puede unirse a la Apo C-III.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que se determina la Apo C-III mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo (EM-TOF) y desorción/ionización por láser mejorada en superficie (SELDI).

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se determina adicionalmente al menos un polipéptido seleccionado de amiloide A sérico, Apo C-I, fragmento de antitrombina III y Apo A-I en la muestra.