Marcadores de masa.

Uso de un conjunto de dos o mas marcadores de masa para analizar un analito por espectrometria de masas,

enel que cada marcador en el conjunto comprende un resto marcador de masa fijado, a traves de un engarce quecomprende un grupo que es escindible en un espectrometro de masas, a un resto de normalizacion de masa, en elque cada resto de normalizacion de masa asegura que un marcador de masa tiene una masa de agregado deseada,y en el que cada resto marcador de masa en el conjunto tiene la misma masa y cada marcador en el conjunto tieneuna masa diferente de aquella de todos los demas marcadores en el conjunto; y en el que los marcadores de masa ylos restos marcadores de masa se identifican por espectrometria de masas y todos los marcadores de masa en elconjunto pueden distinguirse entre si por espectrometria de masas.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07075074.

Solicitante: ELECTROPHORETICS LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: COVEHAM HOUSE DOWNSIDE BRIDGE ROAD COBHAM SURREY KT11 3EP REINO UNIDO.

Inventor/es: SCHMIDT, GUNTER, THOMPSON, ANDREW, HUGIN, JOHNSTONE, ROBERT, ALEXANDER, WALKER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/58 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad).
  • G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

PDF original: ES-2389510_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Marcadores de masa

Esta invención se refiere a compuestos útiles para marcar analitos, particularmente biomoléculas tales como ácidos nucleicos y proteínas. Específicamente esta invención se refiere a métodos de análisis por espectrometría de masas, usando marcadores de masa específicos.

En la técnica se conocen diversos métodos para marcar moléculas de interés, incluyendo átomos radiactivos, tintes fluorescentes, reactivos luminiscentes, reactivos de captura de electrones y tintes absorbedores de luz. Cada uno de estos sistemas de marcaje tiene características que lo hacen adecuado para ciertas aplicaciones y no para otras. Por razones de seguridad, el interés en sistemas de marcaje no radiactivo ha conducido al amplio desarrollo comercial de esquemas de marcaje fluorescente, particularmente para análisis genético. Los esquemas de marcaje fluorescente permiten el marcaje de un número relativamente pequeño de moléculas simultáneamente, típicamente

pueden usarse simultáneamente cuatro marcadores y, posiblemente, hasta ocho. Sin embargo, los costes del aparato de detección y las dificultades de analizar las señales resultantes limitan el número de marcadores que pueden usarse simultáneamente en un esquema de detección por fluorescencia.

Más recientemente ha habido desarrollos en el área de la espectrometría de masas como un método para detectar marcadores que se fijan de forma escindible a su molécula de interés asociada. En muchas aplicaciones de biología molecular es necesario separar las moléculas de interés antes del análisis. Generalmente, se realizan separaciones en fase líquida. La espectrometría de masas en los últimos años ha desarrollado un número de interfaces para separaciones en fase líquida, que hacen a la espectrometría de masas particularmente eficaz como un sistema de detección para estas clases de aplicaciones. Hasta hace poco la espectrometría de masas con cromatografía líquida

se usó para detectar iones de analito o sus fragmentos de iones directamente. Sin embargo, para muchas aplicaciones tales como análisis de ácido nucleico, la estructura del analito puede determinarse a partir del marcaje indirecto. Esto es ventajoso particularmente con respecto al uso de espectrometría de masas debido a que las biomoléculas complejas, tales como ADN, tienen espectros de masas complejos y son detectadas con una sensibilidad relativamente mala. La detección indirecta significa que una molécula marcadora asociada puede usarse para identificar el analito original, estando diseñado el marcador para la detección sensible y tiene un espectro de masas simple. Los espectros de masas simples permiten que múltiples marcadores se usen para analizar una pluralidad de analitos simultáneamente.

El documento WO 98/31830 describe series de sondas de ácido nucleico fijadas covalentemente a marcadores

escindibles que pueden detectarse por espectrometría de masas, que identifican la secuencia de la sonda de ácido nucleico unida covalentemente. Las sondas marcadas de esta solicitud tienen la estructura Nu-L-M, donde Nu es un ácido nucleico unido covalentemente a L, un engarce escindible, unido covalentemente a M, un marcador de masa. Los engarces escindibles preferidos en esta solicitud se escinden dentro de la fuente de iones del espectrómetro de masas. Los marcadores de masa preferidos son poliariléteres sustituidos. Esta solicitud describe una diversidad de métodos de ionización y análisis por analizadores de masas de cuadrupolo, analizadores de tiempo de vuelo (TOF) e instrumentos del sector magnético como métodos específicos para analizar marcadores de masa por espectrometría de masas.

El documento WO 98/15652 describe un método para secuenciar ácido nucleico, especialmente ADN. El método

45 implica escindir ácidos nucleicos para formar fragmentos con extremos adherentes ambiguos. Estos fragmentos se capturan usando bibliotecas de adaptadores. Se prefieren los extremos adherentes ambiguos que tienen cuatro pares de bases y se emplean preferentemente poblaciones de 256 adaptadores que comprenden cada secuencia de cuatro bases posible. También se describe que los adaptadores pueden detectarse usando marcaje de masa puesto que los marcadores de masa escindibles están fijados a los adaptadores.

El documento PCT/GB94/01675 describe ligandos, específicamente ácidos nucleicos, unidos de forma escindible a moléculas marcadoras de masa. Los engarces escindibles preferidos son fotoescindibles. Esta solicitud describe espectrometría de masas de Ionización por Desorción Láser Asistida por Matriz, (MALDI) TOF, como un método específico para analizar los marcadores de masa por espectrometría de masas.

55 El documento PCT/US97/22639 describe moléculas marcadoras de masa no volátiles liberables. En realizaciones preferidas estos marcadores comprenden polímeros, típicamente biopolímeros que pueden fijarse de forma escindible a un grupo reactivo o ligando, es decir, una sonda. Los marcadores escindibles preferidos parecen ser química o enzimáticamente escindibles. Esta solicitud describe espectrometría de masas MALDI TOF como un método específico para analizar marcadores de masa por espectrometría de masas.

Los documentos PCT/US97/01070, PCT/US97/01046 y PCT/US97/01304 describen ligandos y específicamente ácidos nucleicos enlazados de forma escindible a moléculas marcadoras de masa. Los engarces escindibles preferidos parecen ser químicamente o fotoescindibles. Estas solicitudes describen una diversidad de métodos de

65 ionización y análisis por analizadores de masa de cuadrupolo, analizadores TOF e instrumentos del sector magnético como métodos específicos para analizar marcadores de masa por espectrometría de masas.

El documento WO 99/13103 describe un método para ensayar una sustancia, método que comprende poner en contacto la sustancia con un agente de ensayo que comprende un agente catalítico para asociar la sustancia con el agente catalítico, poner en contacto la sustancia asociada resultante con un precursor de marcador y detectar un

marcador, en el que el precursor de marcador es capaz de reaccionar catalíticamente con el agente catalítico para liberar el marcador, y en el que el marcador es un marcador de masa.

El documento WO 99/14362 describe un método para analizar una población de fragmentos de ácidos nucleicos. El método se refiere en particular a la secuenciación de Sanger usando una serie de marcadores de masa unidos de forma escindible a una base de ácido nucleico. Los marcadores de masa son específicos para los nucleótidos individuales a los que están fijados.

El documento WO 99/02728 describe métodos para caracterizar ADN, en particular para obtener información de secuencia. El método funciona proporcionando una población de fragmentos de ADN que están fijados de forma

escindible a marcadores de masa. Los fragmentos se escinden en un espectrómetro de masas para liberar el marcador de masa que se determina por espectrometría de masas. En este método pueden emplearse uniones de amina.

El documento WO 98/31830 describe series de sondas de ácido nucleico unidas covalentemente a marcadores escindibles que pueden detectarse por espectrometría de masas, que identifican la secuencia de la sonda de ácido nucleico unida covalentemente. Las sondas marcadas de esta solicitud tienen la estructura Nu-L-M, donde Nu es un ácido nucleico unido covalentemente a L, un engarce escindible, unido covalentemente a M, un marcador de masa. Los engarces escindibles preferidos en esta solicitud se escinden dentro de la fuente de iones del espectrómetro de masas. Los marcadores de masa preferidos son poliariléteres sustituidos. La solicitud describe una diversidad de

métodos de ionización y análisis por analizadores de masa de cuadrupolo, analizadores de tiempo de vuelo (TOF) e instrumentos del sector magnético como métodos específicos para analizar marcadores de masa por espectrometría de masas.

Dunayevskiy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., Vol. 93, pág. 6152-6157, junio 1996, describe un método de espectrometría de masas para analizar 171 derivados de xanteno disustituidos.

El documento WO 99/32501 describe un grupo de 8 etiquetas para caracterizar ácidos nucleicos. Las etiquetas tienen cada una una masa diferente y están compuestas por marcadores de masa de la misma masa, unidos de forma escindible a restos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Uso de un conjunto de dos o más marcadores de masa para analizar un analito por espectrometría de masas, en el que cada marcador en el conjunto comprende un resto marcador de masa fijado, a través de un engarce que 5 comprende un grupo que es escindible en un espectrómetro de masas, a un resto de normalización de masa, en el que cada resto de normalización de masa asegura que un marcador de masa tiene una masa de agregado deseada, y en el que cada resto marcador de masa en el conjunto tiene la misma masa y cada marcador en el conjunto tiene una masa diferente de aquella de todos los demás marcadores en el conjunto; y en el que los marcadores de masa y los restos marcadores de masa se identifican por espectrometría de masas y todos los marcadores de masa en el

conjunto pueden distinguirse entre sí por espectrometría de masas.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que cada marcador de masa en el conjunto tiene la siguiente estructura:

M (A) y-L-X (A) z

en la que M es un resto de normalización de masa, X es un resto marcador de masa, A es un resto ajustador de masa, L es un engarce escindible, y y z son números enteros de 0 o mayor, e y+z es un número entero de 1 o mayor.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el resto ajustador de masa se selecciona entre:

(a) un sustituyente isotópico situado dentro de la estructura básica del resto marcador de masa y/o dentro de la estructura básica del resto de normalización de masa y

(b) átomos o grupos sustituyentes fijados a la estructura básica del resto marcador de masa y/o fijados a la estructura básica del resto de normalización de masa.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el resto ajustador de masa se selecciona entre un sustituyente

de átomo de halógeno, un grupo metilo y sustituyentes isotópicos 2H o 13C. 30

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el resto ajustador de masa es un sustituyente de átomo de flúor.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el engarce escindible que fija el resto

marcador de masa al resto de normalización de masa es un engarce escindible por colisión. 35

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el engarce escindible comprende un enlace de amida.

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que resto de normalización de masa

comprende un grupo resistente a la fragmentación. 40

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el resto de normalización de masa comprende un grupo fenilo.

10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el resto marcador de masa

comprende un grupo pre-ionizado. 45

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el resto marcador de masa comprende un grupo N-metil piridilo o un grupo seleccionado entre los siguientes grupos: -NH2, -NR2, -NR3+, -SR3+, -SO3 , -PO4-, -PO3-, -CO2 ,

y

en la que R es hidrógeno o es un grupo alifático, aromático, cíclico o heterocíclico sustituido o no sustituido.

12. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-11, en el que cada uno de los marcadores en el conjunto tiene la siguiente estructura:

en la que R es hidrógeno o es un grupo alifático, aromático, cíclico o heterocíclico sustituido o no sustituido; L es un engarce escindible; A es un resto ajustador de masa; cada p es igual y es un número entero de 0 o mayor; cada y' puede ser igual o diferente y es un número entero de 0-4, siendo la suma de todos los y' para cualquier marcador

igual a y; cada z' puede ser igual o diferente y es un número entero de 0-4, siendo la suma de todos los z' para cualquier marcador igual a z; e y+z es un número entero de 1 o mayor.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que R es H, L es un enlace de amida, p=0 y A es un átomo de F.

14. Uso de un conjunto de dos o más sondas para analizar un analito por espectrometría de masas, siendo cada sonda en el conjunto diferente y estando fijada a un marcador de masa único o una combinación única de marcadores de masa seleccionados entre un conjunto de marcadores de masa como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y en el que los marcadores de masa y los restos marcadores de masa se identifican por espectrometría de masas.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que cada sonda está fijada a una combinación única de marcadores de masa, distinguiéndose cada combinación por la presencia y ausencia de cada marcador de masa en el conjunto de marcadores de masa y/o la cantidad de cada marcador de masa fijado a la sonda.

16. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que cada sonda comprende una biomolécula.

17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la biomolécula se selecciona entre ADN, ARN, un

oligonucleótido, una base de ácido nucleico, una proteína y/o un aminoácido. 25

18. Un método de análisis, método que comprende detectar dos o más analitos identificando simultáneamente por espectrometría de masas sus marcadores de masa y sus restos marcadores de masa o una combinación de marcadores de masa y sus restos marcadores de masa, en el que los marcadores de masa son marcadores de masa de un conjunto de marcadores de masa como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que cada analito se identifica por una combinación única de marcadores de masa a partir de un conjunto de marcadores de masa, distinguiéndose cada combinación por la presencia y ausencia de cada marcador de masa en el conjunto o serie y/o la cantidad de cada marcador de masa.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 18 o la reivindicación 19 para identificar dos o más analitos, en el que los analitos se separan de acuerdo con su masa antes de detectar el marcador de masa por espectrometría de masas.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la separación se realiza mediante un método 40 cromatográfico o electroforético.

22. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18-21, en el que el espectrómetro de masas empleado para detectar el marcador de masas comprende uno o más analizadores de masa, analizadores de masa que son capaces de permitir que iones de una masa particular, o de un intervalo de masas, pasen a su través para

45 detección y/o son capaces de provocar que los iones se disocien.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que los iones de una masa o intervalo de masa particular específico para uno o más marcadores de masa conocidos se seleccionan usando el analizador de masa, los iones seleccionados se disocian y los productos de disociación se detectan para identificar patrones de iones indicativos

50 de los marcadores de masa seleccionados.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en el que el espectrómetro de masas comprende analizadores de masa de tres cuadrupolos.

55 25. Un método de acuerdo con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en el que un primer analizador de masa se usa para seleccionar iones de una masa o intervalo de masa particular, un segundo analizador de masa se usa para disociar los iones seleccionados y un tercer analizador de masa se usa para detectar los iones resultantes.

26. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18-25, método que comprende: (a) poner en contacto dos o más analitos con un conjunto de sondas, en el que las sondas son como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 14-17,

(b) identificar un analito, detectando una sonda relacionable con ese analito. 5

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el marcador de masa se escinde de la sonda antes de detectar el marcador de masa por espectrometría de masas.

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 26 o 27, método que comprende poner en contacto dos o más ácidos nucleicos con un conjunto de sondas de hibridación.

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el conjunto de sondas de hibridación comprende un conjunto de hasta 256 tetrámeros, teniendo cada sonda en el conjunto una combinación diferente de bases de ácido nucleico.

30. Un método de análisis espectrométrico de masas bidimensional de acuerdo con la reivindicación 18, método que comprende:

(a) proporcionar dos o más analitos, estando marcado cada analito con un marcador de masa o una combinación de marcadores de masa, en el que los marcadores de masa son de un conjunto de marcadores de masa como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13;

(b) escindir los marcadores de masa de los analitos;

(c) detectar los marcadores de masa;

(d) disociar los marcadores de masa en el espectrómetro de masas para liberar los restos marcadores de masa 25 de los restos de normalización de masa;

(e) detectar los restos marcadores de masa; y

(f) identificar los analitos en base al espectro de masas de los marcadores de masa y el espectro de masas de los restos marcadores de masa.

31. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, en el que en la etapa (c) los marcadores de masa de una masa elegida o un intervalo de masas elegido se seleccionan para la detección y/o en la etapa (e) los restos marcadores de masa que tienen una masa específica se seleccionan para detección.

32. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, método que comprende: 35

(a) someter una mezcla de analitos marcados a un primer tratamiento de separación en base a una primera propiedad de los analitos;

(b) someter los analitos separados resultantes a un segundo tratamiento de separación en base a una segunda propiedad de los analitos; y

(c) detectar un analito detectando su marcador;

en el que los analitos se marcan con un marcador de masa de un conjunto o una serie de marcadores de masa como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

45 33. Un método de acuerdo con la reivindicación 32 en el que en la etapa (a) y/o en la etapa (b) los analitos se separan de acuerdo con su longitud o masa.

34. Un método de acuerdo con la reivindicación 32 o 33 en el que en la etapa (a) y/o la etapa (b) los analitos se separan de acuerdo con su punto isoeléctrico.

35. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

3. 34, en el que los analitos comprenden una proteína, un polipéptido, un péptido, un aminoácido o un ácido nucleico, o fragmentos de los mismos.

36. Un método de electroforesis en gel bidimensional de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

3. 35. 55

37. Un método para caracterizar ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende:

(a) proporcionar una población de fragmentos de ácido nucleico, teniendo cada fragmento fijado de forma escindible al mismo un marcador de masa de un conjunto de marcadores de masa como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para identificar una característica de este fragmento;

(b) separar los fragmentos en base a su longitud;

(c) escindir cada fragmento para liberar su marcador de masa; y

(d) determinar cada marcador de masa por espectroscopía de masas para relacionar la característica de cada

fragmento con la longitud del fragmento. 65

38. Un método de acuerdo con la reivindicación 37 para caracterizar ADNc, método que comprende: (a) exponer una muestra que comprende una población de dos o más ADNc, o fragmentos de los mismos, a un agente de escisión que reconoce una secuencia predeterminada y corta en un sitio de referencia a un desplazamiento conocido desde la secuencia predeterminada proximal a un extremo de cada ADNc o

fragmento del mismo, de manera que genera una población de fragmentos terminales;

(b) ligar cada a cada sitio de referencia un oligonucleótido adaptador que comprende un sitio de reconocimiento para un agente de escisión de muestreo;

(c) exponer la población de fragmentos terminales a un agente de escisión de muestreo que se une al sitio de reconocimiento y corta en un sitio de muestreo de desplazamiento conocido desde el sitio de reconocimiento tal como para generar en cada fragmento terminal una secuencia de extremo adherente de una longitud predeterminada de hasta 6 bases, y de secuencia desconocida;

(d) separar la población de fragmentos terminales en sub-poblaciones de acuerdo con la longitud de la secuencia; y

(e) determinar cada secuencia de extremo adherente mediante: 15

(i) realizar una sonda con una serie de sondas de hibridación marcadas, conteniendo la serie todas las secuencias de bases posibles de la longitud predeterminada;

(ii) ligar aquellas sondas que se hibriden a las secuencias de extremo adherente; y

(iii) determinar qué sondas están ligadas por identificación y, preferentemente, cuantificación de los marcadores;

siendo los marcadores marcadores de masa de un conjunto como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

39. Un método de acuerdo con la reivindicación 38, en el que la población de fragmentos terminales se separa por electroforesis capilar, HPLC o electroforesis en gel.

40. Un método para caracterizar ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, método que comprende generar fragmentos de ácido nucleico de escalera de Sanger a partir de uno o más moldes de ácido nucleico, en presencia de al menos una base de de terminación marcada, identificar la longitud del fragmento y la base de terminación del fragmento, en el que el marcador puede relacionarse con la base de terminación y es un marcador de masa de un conjunto como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

41. Un método de acuerdo con la reivindicación 40, en el que las cuatro bases de terminación están presentes en la 35 misma zona de reacción.

42. Un método de acuerdo con la reivindicación 40 o la reivindicación 41, método que comprende generar fragmentos de ácido nucleico de escalera de Sanger a partir de una pluralidad de moldes de ácido nucleico presentes en la misma zona de reacción y, para cada fragmento de ácido nucleico producido, identificar la longitud del fragmento, la identidad del molde a partir del que procede el fragmento y la base de terminación del fragmento, en el que antes de generar los fragmentos, un nucleótido u oligonucleótido cebador marcador se hibrida a cada molde, siendo el marcador en cada cebador específico para el molde al que se hibrida el cebador para permitir la identificación del molde.

45 43. Un método de acuerdo con la reivindicación 42, en el que el marcador que identifica el molde es un marcador de masa a partir de un conjunto como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

44. Un método para secuenciar ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, método que comprende:

(a) obtener una población de ácido nucleico diana que comprende uno o más ADN de doble cadena a secuenciar, cada uno de los cuales está presente en una cantidad única y lleva un cebador para proporcionar una porción de doble cadena de ácido nucleico para ligamiento al mismo;

(b) poner en contacto la población de ácido nucleico con una serie de sondas de hibridación, comprendiendo cada sonda un marcador fijado de forma escindible a una secuencia de bases conocida de longitud

55 predeterminada, conteniendo la serie todas las posibles secuencias de bases de esa longitud predeterminada y siendo las secuencias de base incapaces de ligamiento entre sí, en el que la puesta en contacto se realiza en presencia de ligasa en condiciones para ligar la porción de doble cadena de cada ácido nucleico a la sonda que lleva la secuencia de bases complementaria al ácido nucleico de una sola cadena adyacente a la porción de doble cadena, formando de esta manera una porción de doble cadena extendida que es incapaz de ligamiento a sondas adicionales; y

(c) retirar todas las sondas no ligadas; seguido de las etapas de:

(d) escindir las sondas ligadas para liberar cada marcador;

(e) registrar la cantidad de cada marcador; y

(f) activar la porción de doble cadena extendida para posibilitar el ligamiento a la misma; en el que

65 (g) las etapas (b) a (f) se repiten en un ciclo durante un número de veces suficiente para determinar la secuencia del o cada ácido nucleico de una sola cadena determinando la secuencia de liberación de cada

marcador,

en el que los marcadores de las sondas de hibridación se seleccionan a partir de un conjunto como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13. 5

45. Un método de acuerdo con la reivindicación 44, en el que las sondas de hibridación son un conjunto de 256 tetrámeros, teniendo cada sonda en el conjunto una combinación diferente de bases de ácido nucleico.

46. Un método para caracterizar una muestra que comprende péptidos, polipéptidos y/o proteínas de acuerdo con la reivindicación 18, método que comprende:

(a) proporcionar una muestra que comprende péptidos, polipéptidos y/o proteínas, teniendo cada péptido, polipéptido y/o proteína fijado de forma escindible al mismo un marcador de masa, o una combinación de marcadores de masa de un conjunto de marcadores de masa como se ha definido en cualquiera de las

reivindicaciones 1-13, en el que cada péptido, polipéptido y/o proteína puede liberarse de su marcador o combinación de marcadores;

(b) analizar los péptidos, polipéptidos y/o proteínas marcados, para detectar los marcadores.

47. Un método de acuerdo con la reivindicación 46, en el que la muestra se proporciona formando péptidos a partir de la acción de un agente escindible sobre una muestra que comprende polipéptidos y/o proteínas.

48. Un método de acuerdo con la reivindicación 46 o la reivindicación 47, en el que los péptidos, polipéptidos y/o proteínas marcados se separan por un método cromatográfico o electroforético, antes del análisis.

49. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

4. 48, en el que se proporciona una pluralidad de muestras.

50. Un método de acuerdo con la reivindicación 49, en el que la pluralidad de muestras se combina, antes del análisis.

51. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

4. 50, en el que uno o más de los péptidos, polipéptidos y/o proteínas en la muestra se modifica post-traduccionalmente y comprende un carbohidrato, y en el que el método comprende biotinilar el péptido, polipéptido o proteína modificados por fijación de biotina a través de un grupo carbonilo del carbohidrato.

52. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

4. 50, en el que uno o más de los péptidos, polipéptidos y/o proteínas en la muestra se modifica post-traduccionalmente mediante fosforilación con tirosina y en el que el método comprende separar tales péptidos, polipéptidos y/o proteínas modificados por cromatografía de afinidad usando un anticuerpo anti-fosfotirosina.

53. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

4. 50, método que comprende aislar un solo fragmento peptídico a partir de cada péptido, polipéptido y/o proteína.

54. Un método de acuerdo con la reivindicación 53, en el que cada fragmento aislado es un fragmento terminal. 45

55. Un método de acuerdo con la reivindicación 54, método que comprende:

(a) tratar una muestra que comprende una población de una pluralidad de polipéptidos con un agente de escisión que se sabe que reconoce en cadenas polipeptídicas un residuo o secuencia de aminoácidos específica, y que se escinde en el sitio de escisión, con lo que la población se escinde para generar fragmentos peptídicos;

(b) aislar una población de fragmentos peptídicos que llevan como un extremo de referencia el extremo N o el extremo C del polipéptido a partir del cual se han fragmentado, llevando cada fragmento peptídico en el otro extremo el sitio de escisión proximal al extremo de referencia;

55 (c) antes o después de aislar los fragmentos peptídicos, marcar cada extremo de referencia de los polipéptidos con un marcador de masa, o una combinación de marcadores de masa a partir de un conjunto de marcadores de masa como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que cada extremo de referencia está relacionado con su marcador o combinación de marcadores; y

(d) determinar por espectrometría de masas una secuencia de firma de uno o más de los fragmentos asilados, secuencia de firma que es la secuencia de un número predeterminado de residuos de aminoácido contando desde el sitio de escisión;

(a) poner en contacto una muestra que comprende uno o más polipéptidos con un primer agente de escisión para generar fragmentos de polipéptido;

(b) aislar uno o más fragmentos de polipéptido, comprendiendo cada fragmento el extremo N o el extremo C del polipéptido a partir del cual se ha fragmentado;

en el que una secuencia de firma caracteriza cada polipéptido.

65 56. Un método de acuerdo con la reivindicación 54, método que comprende:

(c) antes o después de aislar los fragmentos de polipéptido, marcar cada extremo de los polipéptidos con un marcador de masa, o una combinación de marcadores de masa a partir de un conjunto de marcadores de masa como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que cada extremo puede relacionarse con su marcador o combinación de marcadores; y

(d) identificar los fragmentos aislados por espectrometría de masas;

(e) repetir las etapas (a) - (d) en la muestra usando un segundo agente de escisión que se escinde en un sitio diferente del primer agente de escisión; y

(f) caracterizar el uno o más polipéptidos en la muestra a partir de los fragmentos identificados en las etapas (d) y (e) .


 

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