MÉTODO PARA AISLAR ÁCIDOS NUCLEICOS QUE COMPRENDE EL USO DE MULTÍMEROS DE ETILENGLICOL.

Un método de aislar un ácido nucleico de una muestra, dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con un soporte sólido en presencia de un multímero de etilenglicol que consiste en 2 a 20 monómeros de óxido de etileno por el cual el ácido nucleico soluble de dicha muestra se une a la superficie del soporte,

y se separa de dicho soporte con ácido nucleico unido de la muestra

La presente invención se refiere al aislamiento del ácido nucleico, y en especial al aislamiento del ADN o ARN de las muestras.

El aislamiento del ADN o ARN es una etapa importante en muchos procedimientos bioquímicos y diagnósticos. Por ejemplo, en la separación de los 5 ácidos nucleicos de las muestras complejas en las que ellos se hallan a menudo, con frecuencia es necesario poder llevar a cabo antes otros estudios y procedimientos, por ejemplo, detección, clonación, secuenciación, amplificación, hibridación, síntesis de ADNc, estudio de la estructura y composición del ácido nucleico (por ejemplo, el patrón de metilación del ADN), etc.; la presencia de 10 grandes cantidades de material celular u otro contaminante, por ejemplo, proteínas o carbohidratos, en tales mezclas complejas a menudo impide muchas de las reacciones y técnicas usadas en biología molecular. Además, el ADN puede contaminar las preparaciones de ARN y viceversa. En consecuencia, se necesitan métodos para el aislamiento de los ácidos nucleicos de mezclas complejas tales 15 como células, tejidos, etc., no solo desde el punto de vista preparativo, sino también en los diversos métodos en uso actuales que se basan en la identificación del ADN o ARN por ejemplo, diagnóstico de infecciones microbianas, ciencia forense, tipificación de tejido y sangre, genotipificación, detección de variaciones genéticas, etc. La purificación del ADN o ARN de muestras más enriquecidas pero aún 20 contaminadas también es conveniente, por ejemplo, para purificar material nucleico preparado sintéticamente, por ejemplo, para purificar los productos de PCR de las sales contaminantes, cebadores en exceso y/o dNTP.

En particular en los campos de diagnóstico de ácido nucleico, estudios y genotipificación de la población, es importante obtener preparaciones de ácido 25 nucleico de alta calidad y puras para asegurar que las etapas posteriores de amplificación y/o detección se pueden llevar a cabo de modo confiable y preciso.

En las identificaciones del ARN es importante para un diagnóstico conclusivo tener la certeza de que la secuencia detectada deriva de una molécula de ARN y no de la contaminación del ADN genómico de la muestra. Por esta razón, 30 los métodos para la separación del ARN a partir del ADN son importantes. Asimismo, se requieren métodos de aislamiento de ARN rápidos ya que las moléculas de ARN usualmente son muy inestables y se degradan rápidamente con las ARnasas presentes en las células y fluidos corporales. La calidad del ARN es probablemente el factor más importante para determinar la calidad de los resultados 35 finales en los protocolos que utilizan ARNm, en especial para la síntesis de ADNc. Es importante evitar la contaminación del ADN de las preparaciones de ARN por numerosas razones. En primer lugar, el ADN aumenta la viscosidad lo que hace difícil la manipulación de la muestra y lleva a un escaso rendimiento de ARN y también a ARN de escasa calidad con la probabilidad de la contaminación del ADN. 5 Asimismo, la contaminación del ADN puede captar enzimas de ARNasa y hacer que aplicaciones posteriores tales como RT-PCR no tengan valor.

Una variedad de métodos son conocidos para el aislamiento de los ácidos nucleicos, pero en términos generales, estos se basan en una serie compleja de etapas de extracción y lavado y requieren tiempo y son laboriosos de realizar. 10 Además, a menudo está involucrado el uso de materiales tales como alcoholes y otros solventes orgánicos, caotropos y proteinasas, lo que es desventajoso ya que tales materiales tienden a interferir con muchas reacciones enzimáticas y otras aplicaciones de procesamiento posteriores.

En consecuencia, los métodos clásicos para el aislamiento de los ácidos 15 nucleicos de los materiales iniciales complejos tales como sangre o productos de sangre o tejidos involucra la lisis del material biológico por un detergente o caotropo, posiblemente en presencia de enzimas degradadoras de proteína, seguido por varias extracciones con solventes orgánicos por ejemplo, fenol y/o cloroformo, precipitación con etanol, centrifugaciones y diálisis de los ácidos 20 nucleicos. La purificación del ARN a partir del ADN puede involucrar una precipitación selectiva con LiCl o un aislamiento selectivo con tiocianato de guanidinio ácido combinado con extracciones con fenol y precipitación en etanol. No solo dichos métodos son engorrosos y laboriosos de realizar, sino que el número relativamente grande de etapas requeridas aumenta el riesgo de 25 degradación, pérdida de muestra o contaminación cruzada de las muestras donde varias muestras se procesan simultáneamente. En el caso del aislamiento del ARN, el riesgo de contaminación con ADN es relativamente alto.

En la purificación del ARN, comúnmente se desea aislar específicamente ARNm. La mayoría de las estrategias de purificación del ARNm involucran el 30 aislamiento del ARN total y el fraccionamiento del ARN aislado. La preparación de ARNm de alta calidad es una etapa importante en el análisis de la estructura del gen y la regulación del gen.

La mayor parte de los ARNm eucarióticos tienen una cola poli(A), normalmente de aproximadamente 50 a 300 nucleótidos de largo. Tal ARNm se 35 denomina como ARNm poliadenilado o poli(A)+. En la separación de este ARN poliadenilado a partir del ARN no adenilado que representa 95% o más de un ARN total de la célula, se aprovecha esta cola poli(A) y se realiza algún tipo de separación por afinidad dirigida a la cola poli(A). La tecnología convencional ha involucrado la purificación del ARN total como una primera etapa y la selección del 5 ARN de poli(A)+ por cromatografía de afinidad mediante el uso de oligo(dT)-celulosa como la segunda etapa. Esta estrategia, lleva tiempo y es relativamente laboriosa. Una estrategia alternativa para la purificación del ARNm es usar oligo(dT) ligado a los soportes sólidos tales como microplacas, látex, agarosa o perlas magnéticas. 10

Durante los últimos años se ha vuelto cada vez más popular emplear una estrategia asistida por perlas magnéticas para la selección de ARN poli(A)+ ya que se ha comprobado que tales perlas son favorables en las manipulaciones del ARNm. En muchos abordajes, el rendimiento y la calidad de los productos depende de qué rápido se pueda purificar el ARNm de las nucleasas y otros contaminantes. 15 Por el uso de la tecnología de separación de perlas magnéticas, se puede obtener ARN de poli(A)+ puro e intacto rápidamente a partir de las preparaciones de ARN totales o aun con mayor importancia, directamente de los lisados crudos de los tejidos sólidos, células o fluidos corporales. El procedimiento completo se puede llevar a cabo en un tubo de microcentrífuga sin extracciones en fenol o 20 precipitaciones con etanol.

Un abordaje común en la purificación del ADN, que se puede usar en conjunto con un abordaje en fase sólida es realizar la lisis del material biológico y la posterior hibridación a oligo dT en LiCl y buffer de LiDS/SDS, de este modo se evitan las etapas extra tales como extracción en fenol o digestión con proteinasa K. 25 El aislamiento del ARNm directo total lleva aproximadamente 15 minutos y debido a que el ARNm es estable durante más de 30 minutos en el buffer de lisis, esto garantiza la alta calidad del ARNm purificado. Sin embargo, una desventaja de este método es que el ARNm por unidad de peso del tejido es afectado por la cantidad de tejido usado y por encima de un umbral crítico de células lisadas, el rendimiento 30 del ARNm disminuye.

Otro abordaje común para la purificación de ARNm directa es, como se mencionó antes, usar isotiacianato de guanidinio (GTC) y sarcosilo. La mayoría de los investigadores prefiere un sistema de GTC-buffer debido a la capacidad de esta sal caotrópica de inhibir las ARNasas. Esto también se puede usar en combinación 35 con el abordaje de perlas magnéticas. Sin embargo, la viscosidad de los lisados celulares en 4 M de GTC es alta y las perlas no son atraídas efectivamente por el imán, lo que da como resultado un aumento del riesgo de la contaminación del ADN, tanto para las perlas como para otras fases sólidas, y menores rendimientos.

Más recientemente, se han propuesto otros métodos que se basan en el uso 5 de una fase sólida. El documento US-A-5.234.809, por ejemplo, describe un método donde los ácidos nucleicos se unen a una fase sólida en la forma de partículas de sílice, en presencia de un agente caotrópico tal como una sal de guanidinio, y de este modo se separan del resto de la muestra. El documento WO 91/12079 describe un método por el cual un ácido nucleico...

Reivindicaciones

1. Un método de aislar un ácido nucleico de una muestra, dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con un soporte sólido en presencia de un multímero de etilenglicol que consiste en 2 a 20 monómeros de óxido de etileno por el cual el ácido nucleico soluble de dicha muestra se une a la superficie del 5 soporte, y se separa de dicho soporte con ácido nucleico unido de la muestra.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dichos monómeros de óxido de etileno están en una disposición lineal.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el que dicho multímero es un oligoetilenglicol con 10 o menos unidades de óxido de etileno, 10 preferentemente entre 2 y 6 unidades de óxido de etileno.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho multímero es tetraetilenglicol.

5. A método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que dicho multímero de etilenglicol se usa en una concentración final mayor que 15 15% de, preferiblemente 15 - 35%.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicha etapa de unión de dicho ácido nucleico a dicho soporte sólido se realiza en presencia de sal a una concentración final de menos de 1 M, preferentemente de 5 mM de a 0,5 M. 20

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que dicho método se realiza en presencia de alcohol a una concentración final menor de 30% de (v/v).

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dicha muestra se pone contacto con un detergente antes, 25 simultáneamente o después del contacto de dicha muestra con el multímero de etilenglicol y dicho detergente está presente en una concentración final de 0,2 a 30% de (p/v)

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 en el que dicho detergente es un detergente aniónico, preferentemente un sal alquilsulfato de metal alcalino. 30

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dicho método se realiza en presencia de menos de 1% (p/v) de detergente, menos de 30% (v/v) de alcohol y en ausencia de caotropos.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 en el que dicho método se realiza en ausencia de uno o más de detergentes, caotropos y alcoholes. 35

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 en el que el multímero de etilenglicol se usa solo en una solución buffer.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la separación de las moléculas de ácido nucleico de más de 100 pares de bases de oligonucleótidos de menos de 30 nucleótidos. 5

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que comprende adicionalmente la etapa de eluir el ácido nucleico del soporte sólido y opcionalmente realizar procesos posteriores adicionales, preferentemente la secuenciación, de dicho material eluido.

15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 14, en el que dicho ácido nucleico es ADN, preferentemente fragmentos de ADN no genómico de 10 pares de bases a 250 kb.

16. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el ADN está aislado y adicionalmente en una etapa más se aísla ARN de la misma muestra. 15

17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el que dicha muestra es sangre entera o un producto derivado de la sangre.

18. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el que dicha muestra es una muestra obtenida después de un proceso de amplificación. 20

19. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que además comprende una o más etapas adicionales para alterar los componentes estructurales en la misma muestra o para lograr la lisis de las células en la muestra.

20. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 25 en el que dicho soporte sólido es particulado.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20 en el que el soporte sólido comprende perlas magnéticas.

22. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en el que la superficie de dicho soporte sólido es hidrófila. 30

23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 en el que dicho soporte sólido porta grupos hidroxilo, epoxi, ácido carboxílico o ácido sulfónico.

24. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 en el que después de la unión del ácido nucleico dicho soporte sólido se lava, 35 preferentemente con una solución que contiene menos de 250 mM de sal y alcohol de entre 50 y 90%.

25. Un kit para aislar el ácido nucleico de una muestra de acuerdo con el método que se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende un multímero de etilenglicol definido de acuerdo con una cualquiera de 5 las reivindicaciones 1 a 4 y un soporte sólido.

26. Un kit de acuerdo con la reivindicación 25 en el que dicho soporte sólido es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.

27. Un kit de acuerdo con la reivindicación 25 o 26 que adicionalmente comprende un folleto con instrucciones para el uso del kit de acuerdo con el método 10 que se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

28. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o 19 a 24 en el que dicha muestra contiene células y dichas células se obtienen por separación inmunomagnética.

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28 en el que dicho método 15 además comprende la etapa adicional de aislar el ARN de dicha muestra.

30. Un método de acuerdo con la reivindicación 28 o 29 en el que dichas células están en un complejo de células:perla.