MARCADORES PARA LA DETECCIÓN DEL CÁNCER GÁSTRICO.

[0001] Esta solicitud reivindica prioridad según 35 U.S.C. 119 respecto a la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos de Nº de Serie: 60/487.906, presentada el 17 de julio de 2003, titulada Marcadores para la detección del cáncer gástrico, que enumera a Parry John Guilford como inventor. Campo de la invención [0002] Esta invención se refiere a la detección del cáncer. En concreto, esta invención se refiere al uso de marcadores genéticos y/o proteicos para la detección del cáncer y, más particularmente, al uso de marcadores genéticos y/o proteicos para la detección del cáncer gástrico. ANTECEDENTES [0003] La supervivencia de pacientes con cáncer se aumenta enormemente cuando el cáncer se detecta y se trata 20 de forma temprana. En el caso del cáncer gástrico, los pacientes diagnosticados con una enfermedad en fase temprana tienen tasas de supervivencia a 5 años del 90%, en comparación con de aproximadamente el 10% para pacientes diagnosticados con una enfermedad avanzada. Sin embargo, la gran mayoría de los pacientes con cáncer gástrico se presentan actualmente con una enfermedad avanzada. Por lo tanto, los desarrollos que conducen a un diagnóstico temprano del cáncer gástrico pueden conducir a un pronóstico mejorado para los pacientes. [0004] La identificación de marcadores específicos asociados a cáncer en muestras biológicas, incluyendo fluidos corporales, por ejemplo, sangre, orina, lavados peritoneales y extractos de heces puede proporcionar una estrategia valiosa para el diagnóstico temprano del cáncer, conduciendo al tratamiento temprano y a un pronóstico mejorado. Los marcadores específicos de cáncer también pueden proporcionar un medio para controlar la progresión de la 30 enfermedad, permitiendo realizar un seguimiento de la eficacia de tratamientos quirúrgicos, radioterápicos y quimioterápicos. Sin embargo, para varios cánceres de gran importancia, los marcadores disponibles experimentan una sensibilidad y especificidad insuficientes. Por ejemplo, los marcadores usados más frecuentemente para el cáncer gástrico, ca19-9, ca72-4 y antígeno corioembrionario (CEA), detectan sólo aproximadamente el 15-50% de los tumores gástricos en cualquier fase, disminuyendo hasta aproximadamente el 2-11% para la enfermedad en fase 35 temprana. Por lo tanto, existe una frecuencia muy elevada de ensayos falsos negativos que puede llevar a que los pacientes y el personal de atención sanitaria crean que no existe enfermedad, mientras que de hecho el paciente puede tener un cáncer grave que requiera una atención inmediata. Además, estos marcadores pueden dar señales falsas positivas en hasta 1/3 de los individuos afectados por una enfermedad gástrica benigna. 40 [0005] El documento WO01/94629 describe 568 marcadores de expresión asociados con cáncer gástrico, 314 genes regulados positivamente y 254 genes regulados negativamente. Uno de ellos, identificado mediante la SEC ID Nº: 2756, corresponde al gen CST1 y se dice que está regulado positivamente en muestras de tumores gástricos (página 18, líneas 5-10; SEC ID Nº: 2756).   EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN ES 2 369 667 T3 [0006] Por lo tanto, existe una necesidad aguda de mejores métodos para detectar la presencia de cáncer. Aspectos de esta descripción describen métodos, composiciones y dispositivos que pueden proporcionarse para la detección del cáncer en fase temprana, y que disminuyen la frecuencia de resultados de ensayo falsos positivos y falsos negativos. [0007] Por lo tanto, la invención se refiere a un método para detectar el cáncer gástrico, que comprende detectar niveles de proteína aumentados de un miembro de la familia de GTM en una muestra biológica seleccionada de sangre, suero y plasma, caracterizado por que el miembro de la familia de GTM es cistatina SN (CST1). [0008] Algunas de las realizaciones de detección de GTM descritas en la presente memoria están sobreexpresadas de una forma altamente selectiva en células tumorales y de forma escasa, si en absoluto, en células no tumorales, permitiendo una detección sensible y precisa del cáncer con la medición de un solo GTM sobreexpresado. En otras realizaciones, puede detectarse la sobreexpresión de dos, tres o más GTM en una muestra y puede proporcionar mayor certeza de diagnóstico. [0009] Los genes seleccionados que codifican proteínas pueden secretarse por o escindirse a partir de la célula. Estas proteínas, en solitario o en combinación entre sí, tienen utilidad como marcadores de suero o fluido corporal para el diagnóstico del cáncer gástrico o como marcadores para controlar la progresión de una enfermedad 2   establecida. La detección de marcadores proteicos puede llevarse a cabo usando métodos conocidos en la técnica, e incluyen el uso de anticuerpos monoclonales, antisueros policlonales y similares. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS [0010] Esta invención se ilustra en general con referencia a las figuras, en las que: La Figura 1 representa una tabla de marcadores y secuencias oligonucleotídicas de marcadores para cáncer gástrico de esta invención. La Figura 2 representa una tabla de resultados obtenidos de estudios llevados a cabo usando métodos de micromatrices. La Figura 3 representa una tabla de resultados obtenidos de estudios llevados a cabo usando PCR cuantitativa. Las Figuras 4a-4d representan las relaciones entre el log2 de resultados en veces obtenidos usando métodos de matrices y qPCR, en los que los datos se centran sobre la mediana normal para cuatro marcadores de cáncer gástrico. Los cuadrados grises corresponden a muestras no malignas (normales) y los triángulos negros a muestras tumorales. Figura 4a: ASPN. Figura 4b: SPP1. Figura 4c: SPARC. Figura 4d: MMP12. Las Figuras 5a-5w representan histogramas que muestran los datos de frecuencia relativa frente al log2 del cambio en veces obtenidos a partir de estudios de PCR cuantitativa de diversos marcadores tumorales. Figura 5a: ASPN; Figura 5b: CST1,2 y 4; Figura 5c: CSPG2; Figura 5d: IGFBP7; Figura 5e: INHBA; Figura 5f: LOXL2; Figura 5g: LUM; Figura 5h: SFRP4; Figura 5i: SPARC; Figura 5j: SPP1; Figura 5k: THBS2; Figura 5l: TIMP1; Figura 5m: adlicán; Figura 5n: PRS11; Figura 5o: ASAH1; Figura 5p: SFRP2; Figura 5q: GGH; Figura 5r: MMP12; Figura 5s: KLK10; Figura 5t: LEPRE1; Figura 5u: TG; Figura 5v: EFEMP2 y Figura 5w: TGFBI. La Figura 6 es un histograma que muestra el número de marcadores con una expresión superior al 95º percentil de la mediana de la expresión normal. Los resultados se basan en los datos de qPCR y se muestran por separado para cada muestra tumoral. ES 2 369 667 T3 Las Figuras 7a-7c representan gráficas que muestran el log2 de expresión relativa de los marcadores en muestras tumorales individuales y muestras no malignas en comparación con la expresión del gen para el marcador tumoral, CEA. CEA es el marcador sérico más usado actualmente para controlar la progresión del cáncer gástrico. La Figura 3 muestra una tabla que complementa la Figura 3. La Figura 8 resume los niveles de expresión determinados por qPCR para los marcadores tumorales candidato, pero usando los datos relacionados (es decir, muestras tumorales (T) y no malignas (N) del mismo individuo) para proporcionar una relación de T:N. La Figura 8 también incluye marcadores adicionales no incluidos en la Figura 3, en concreto MMP2, CGR11, TGFB1, PCSK5, SERPINB5, SERPINH1. Por comparación, también se muestra el nivel de expresión del gen de marcador sérico establecido, CEACAM5 (CEA). 27 de los 29 marcadores tienen una diferencia de T:N mediana superior a o igual a CEA. Además, en comparación con CEA, 29/29 de los marcadores tienen un mayor porcentaje de muestras relacionadas en las que la expresión en la muestra tumoral supera la expresión en la muestra normal. Tres marcadores, CST1,2,44, ASPN y SFRP4, mostraron una discriminación del 100% entre las muestras tumorales y normales relacionadas. Las secuencias génicas de estos marcadores y la localización de los cebadores y sondas usados para detectarlas se muestran en la presente memoria. Las Figuras 9a-9d representan los datos del cambio en veces de T:N individuales y la mediana para 29 marcadores de cáncer gástrico en 40 pacientes con muestras relacionadas. Las Figuras 10a-10ad representan gráficas de la fase tumoral y del log2 del cambio en veces en la expresión de CEA y otros GTM de esta invención. Figura 10a: adlicán; Figura 10b: ASPN; Figura 10c: CSPG2; Figura 10d: CST1,2,4; Figura 10e: EFEMP2; Figura 10f: GGF; Figura 10g: INHBA; Figura 10h: IGFBP7; Figura 10i: KLK10; Figura 10j: LEPRE1; Figura 10k: LUM; Figura 10l: LOXL2; Figura 10m: MMP12; Figura 10n;TIMP1; Figura 10o: ASAH1; Figura 10p: SPP1; Figura 10q SFRP2; Figura 10r. SFRP4; Figura 10s: SPARC; Figura 10t: PRSS11; Figura 10u: THBS2: Figura 10v: TG; Figura 10w: TGFBI; Figura 10x: CGR11; Figura 10y: SERPINH1; Figura 10z: MMP2;... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar cáncer gástrico, que comprende detectar niveles de proteína aumentados de un miembro de la familia de GTM en una muestra biológica seleccionada de sangre, suero y plasma, caracterizado por que el miembro de la familia de GTM es cistatina SN (CST1). 2. Un método de la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional de comparar la cantidad de GTM presente en dicha muestra de ensayo con un valor obtenido a partir de una muestra de control de un sujeto que no tiene cáncer gástrico. 3. El método de la reivindicación 1, que comprende detectar la sobreexpresión de al menos un miembro de la familia de GTM adicional seleccionado del grupo que consiste en carboxipeptidasa N, polipéptido 2, cadena de 83 kDa (CPN2), metaloproteinasa de la matriz 12 (mump12), inhibina (INHBA), factor de crecimiento de tipo insulina 7 (IGFBP7), gamma-glutamil hidrolasa (GGH), proteoglicano enriquecido con leucina-prolina (LEPRE1), cistatina S (CST4), proteína relacionada con Frizzled secretada 4 (SFRP4), asporina (ASPN), regulador de crecimiento celular con dominio de mano EF 1 (CGREF1), calicreína 10 (KLK10), inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 (TIMP1), proteína rica en cisteína ácida secretada (SPARC), factor de crecimiento transformante, -inducido (TGFBI), proteína de la matriz extracelular de tipo fibulina que contiene EGF 2 (EFEMP2), lumicán (LUM), estanina (SNN), fosfoproteína secretada 1 (SPP1), proteoglicano de sulfato de condroitina 2 (CSPG2), N- acilesfingosina amidohidrolasa (ASAH1), serina proteasa 11 (PRSS11), proteína relacionada con Frizzled secretada 2 (SFRP2), fosfolipasa A2, grupo XIIB (PLA2G12B), espondina 2, proteína de la matriz extracelular (SPON2), olfactomedina 1 (OLFM1), trombospondina que contiene repeticiones 1 (TSRC1), trombospondina 2 (THBS2), adlicán, cistatina SA (CST2), enzima de tipo lisil oxidasa 2 (LOXL2), tiroglobulina (TG), factor de crecimiento transformante betal (TGFB1), inhibidor de serina o cisteína proteinasa, clado H (SERPINH1), inhibidor de serina o cisteína proteinasa, clado B (SERPINB5), metaloproteinasa de la matriz 2 (MMP2), proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 (PCSK5) y proteína ligada a glicoproteína de hialuronano 4 (HAPLN4). 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la etapa de detección se lleva a cabo usando un anticuerpo dirigido contra dicho GTM. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la etapa de detección se lleva a cabo usando un método de inmunoensayo de tipo sándwich. 6. El método de la reivindicación 4 ó 5, caracterizado por que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 7. El método de 4 ó 5, caracterizado por que el anticuerpo es un antisuero policlonal. 8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la etapa de medición usa un ensayo de ELISA. 153   ES 2 369 667 T3 154   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 156   ES 2 369 667 T3 157   ES 2 369 667 T3 158   ES 2 369 667 T3 159   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 161   ES 2 369 667 T3 162   ES 2 369 667 T3 163   ES 2 369 667 T3 164   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 166   ES 2 369 667 T3 167   ES 2 369 667 T3 168   ES 2 369 667 T3 169   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 171   ES 2 369 667 T3 172   ES 2 369 667 T3 173   ES 2 369 667 T3 174   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 176   ES 2 369 667 T3 177   ES 2 369 667 T3 178   ES 2 369 667 T3 179   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 181   ES 2 369 667 T3 182   ES 2 369 667 T3 183   ES 2 369 667 T3 184   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 186   ES 2 369 667 T3 187   ES 2 369 667 T3 188   ES 2 369 667 T3 189   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 191   ES 2 369 667 T3 192   ES 2 369 667 T3 193   ES 2 369 667 T3 194   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 196   ES 2 369 667 T3 197   ES 2 369 667 T3 198   ES 2 369 667 T3 199   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 201   ES 2 369 667 T3 202   ES 2 369 667 T3 203   ES 2 369 667 T3 204   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 206   ES 2 369 667 T3 207   ES 2 369 667 T3 208   ES 2 369 667 T3 209   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 211   ES 2 369 667 T3 212   ES 2 369 667 T3 213   ES 2 369 667 T3 214   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 216   ES 2 369 667 T3 217   ES 2 369 667 T3 218   ES 2 369 667 T3 219   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 221   ES 2 369 667 T3 222   ES 2 369 667 T3 223   ES 2 369 667 T3 224   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 226   ES 2 369 667 T3 227   ES 2 369 667 T3 228   ES 2 369 667 T3 229   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 231   ES 2 369 667 T3 232   ES 2 369 667 T3 233   ES 2 369 667 T3 234   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 236   ES 2 369 667 T3 237   ES 2 369 667 T3 238   ES 2 369 667 T3 239   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 241   ES 2 369 667 T3 242   ES 2 369 667 T3 243   ES 2 369 667 T3 244   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 246   ES 2 369 667 T3 247   ES 2 369 667 T3 248   ES 2 369 667 T3 249   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 251   ES 2 369 667 T3 252   ES 2 369 667 T3 253   ES 2 369 667 T3 254   ES 2 369 667 T3   ES 2 369 667 T3 256   ES 2 369 667 T3 257 REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN 5 Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.   Documentos de patentes citados en la descripción ES 2 369 667 T3 US 60487906 B [0001] [0196] WO 0194629 A [0005] Literatura diferente de patentes citadas en la descripción Gunner; Heijne. Journal of Molecular Biology, 1984, vol. 173, 243251 [0084] Hotte et al. Cancer, 2002, vol. 95 (3), 507-510 [0134] Martin et al. Prostate Cancer Prostateic Dis., 09 March 2004 [0134] [0143] Hall et al. Laryngoscope, 2003, vol. 113 (1), 77-81 [0134] [0144] Mazzaferri et al. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2003, vol. 88 (4), 1433-14421 [0134] Kuo et al. Clin. Chem. Acta., 2000, vol. 294 (1-2), 157-168 [0134] Pellegrini et al. Cancer Immunol. Immunother, 2000, vol- 49 (7), 388-394 [0134] [0149] Yoshikawa et al. Cancer Letters, 2000, vol. 151, 81-86 [0138] Rudland et al. 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