Marcadores para la detección del cáncer gástrico.

Un método para detectar cáncer gástrico, que comprende:

(a) proporcionar un muestra biológica;

y

(b) detectar la sobreexpresión de un miembro de la familia GTM en dicha muestra, caracterizado porque el miembro de la familia GTM es un inhibidor de la serina o cisteína proteinasa clado H ("SERPINH1)

Marcadores para la detección del cáncer gástrico

ANTECEDENTES

La supervivencia de pacientes con cáncer se aumenta enormemente cuando el cáncer se detecta y se trata de forma temprana. En el caso del cáncer gástrico, los pacientes diagnosticados con una enfermedad en fase temprana tienen tasas de supervivencia a 5 años del 90%, en comparación con de aproximadamente el 10% para pacientes diagnosticados con una enfermedad avanzada. Sin embargo, la gran mayoría de los pacientes con cáncer gástrico se presentan actualmente con una enfermedad avanzada. Por lo tanto, los desarrollos que conducen a un diagnóstico temprano del cáncer gástrico pueden conducir a un pronóstico mejorado para los pacientes.

La identificación de marcadores específicos asociados a cáncer en muestras biológicas, incluyendo fluidos corporales, por ejemplo, sangre, orina, lavados peritoneales y extractos de heces puede proporcionar una estrategia valiosa para el diagnóstico temprano del cáncer, conduciendo al tratamiento temprano y a un pronóstico mejorado. Los marcadores específicos de cáncer también pueden proporcionar un medio para controlar la progresión de la enfermedad, permitiendo realizar un seguimiento de la eficacia de tratamientos quirúrgicos, radioterápicos y quimioterápicos. Sin embargo, para varios cánceres de gran importancia, los marcadores disponibles experimentan una sensibilidad y especificidad insuficientes. Por ejemplo, los marcadores usados más frecuentemente para el cáncer gástrico, ca19-9, ca72-4 y antígeno corioembrionario (CEA) , detectan sólo aproximadamente el 15-50% de los tumores gástricos en cualquier fase, disminuyendo hasta aproximadamente el 2-11% para la enfermedad en fase temprana. Por lo tanto, existe una frecuencia muy elevada de ensayos falsos negativos que puede llevar a que los pacientes y el personal de atención sanitaria crean que no existe enfermedad, mientras que de hecho el paciente puede tener un cáncer grave que requiera una atención inmediata. Además, estos marcadores pueden dar señales falsas positivas en hasta 1/3 de los individuos afectados por una enfermedad gástrica benigna.

WO 98/41864 describe métodos para el diagnóstico temprano de cáncer gástrico mediante la detección de expresión incrementada de mRNA o proteína COX2.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Por lo tanto, existe una necesidad aguda de mejores métodos para detectar la presencia de cáncer. Aspectos de esta descripción describen métodos, composiciones y dispositivos que pueden proporcionarse para la detección del cáncer en fase temprana, y que disminuyen la frecuencia de resultados de ensayo falsos positivos y falsos negativos.

Por lo tanto, la invención se refiere a un método para detectar cáncer gástrico, que comprende:

(a) proporcionar una muestra biológica; y

(b) detectar la sobreexpresión de un miembro de la familia GTM en dicha muestra, caracterizado porque el miembro de la familia de GTM es un inhibidor de la serina o cisteína proteinasa clado H (“SERPINH1”) .

Algunas de las realizaciones de detección de GTM descritas en la presente memoria están sobreexpresadas de una forma altamente selectiva en células tumorales y de forma escasa, si en absoluto, en 45 células no tumorales, permitiendo una detección sensible y precisa del cáncer con la medición de un solo GTM sobreexpresado. En otras realizaciones, puede detectarse la sobreexpresión de dos, tres o más GTM en una muestra y puede proporcionar mayor certeza de diagnóstico.

Los genes seleccionados que codifican proteínas pueden secretarse por o escindirse a partir de la célula.

Estas proteínas, en solitario o en combinación entre sí, tienen utilidad como marcadores de suero o fluido corporal para el diagnóstico del cáncer gástrico o como marcadores para controlar la progresión de una enfermedad establecida. La detección de marcadores proteicos puede llevarse a cabo usando métodos conocidos en la técnica, e incluyen el uso de anticuerpos monoclonales, antisueros policlonales y similares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Esta invención se ilustra en general con referencia a las figuras, en las que:

La Figura 1 representa una tabla de marcadores y secuencias oligonucleotídicas de marcadores para cáncer

gástrico de esta invención. La Figura 2 representa una tabla de resultados obtenidos de estudios llevados a cabo usando métodos de micromatrices. La Figura 3 representa una tabla de resultados obtenidos de estudios llevados a cabo usando PCR cuantitativa. Las Figuras 4a-4d representan las relaciones entre el log2 de resultados en veces obtenidos usando métodos de

matrices y qPCR, en los que los datos se centran sobre la mediana normal para cuatro marcadores de cáncer gástrico. Los cuadrados grises corresponden a muestras no malignas (“normales”) y los triángulos negros a muestras tumorales. Figura 4a: ASPN. Figura 4b: SPP1. Figura 4c: SPARC. Figura 4d: MMP12. Las Figuras 5a-5w representan histogramas que muestran los datos de frecuencia relativa frente al log2 del

cambio en veces obtenidos a partir de estudios de PCR cuantitativa de diversos marcadores tumorales. Figura 5a: ASPN; Figura 5b: CST1, 2 y 4; Figura 5c: CSPG2; Figura 5d: IGFBP7; Figura 5e: INHBA; Figura 5f: LOXL2; Figura 5g: LUM; Figura 5h: SFRP4; Figura 5i: SPARC; Figura 5j: SPP1; Figura 5k: THBS2; Figura 5l: TIMP1; Figura 5m: adlicán; Figura 5n: PRS11; Figura 5º: ASAH1; Figura 5p: SFRP2; Figura 5q: GGH; Figura 5r: MMP12; Figura 5s: KLK10; Figura 5t: LEPRE1; Figura 5u: TG; Figura 5v: EFEMP2 y Figura 5w: TGFBI.

La Figura 6 es un histograma que muestra el número de marcadores con una expresión superior al 95º percentil de la mediana de la expresión normal. Los resultados se basan en los datos de qPCR y se muestran por separado para cada muestra tumoral. Las Figuras 7a-7c representan gráficas que muestran el log2 de expresión relativa de los marcadores en muestras tumorales individuales y muestras no malignas en comparación con la expresión del gen para el

marcador tumoral, CEA. CEA es el marcador sérico más usado actualmente para controlar la progresión del cáncer gástrico. La Figura 3 muestra una tabla que complementa la Figura 3. La Figura 8 resume los niveles de expresión determinados por qPCR para los marcadores tumorales candidato, pero usando los datos relacionados (es decir, muestras tumorales (“T”) y no malignas (“N”) del mismo individuo) para proporcionar una relación de T:N. La Figura 8 también incluye marcadores adicionales no incluidos en la Figura 3, en concreto MMP2, CGR11, TGFB1, PCSK5, SERPINB5, SERPINH1. Por comparación, también se muestra el nivel de expresión del gen de marcador sérico establecido, CEACAM5 (CEA) . 27 de los 29 marcadores tienen una diferencia de T:N mediana superior a o igual a CEA. Además, en comparación con CEA, 29/29 de los marcadores tienen un mayor porcentaje de muestras relacionadas en las que la expresión en la muestra tumoral supera la expresión en la muestra normal. Tres marcadores, CST1, 2, 44, ASPN y SFRP4, mostraron una discriminación del 100% entre las muestras tumorales y normales relacionadas. Las secuencias génicas de estos marcadores y la localización de los cebadores y sondas usados para detectarlas se muestran en la presente memoria. Las Figuras 9a-9d representan los datos del cambio en veces de T:N individuales y la mediana para 29 marcadores de cáncer gástrico en 40 pacientes con muestras relacionadas.

Las Figuras 10a-10ad representan gráficas de la fase tumoral y del log2 del cambio en veces en la expresión de CEA y otros GTM de esta invención. Figura 10a: adlicán; Figura 10b: ASPN; Figura 10c: CSPG2; Figura 10d: CST1, 2, 4; Figura 10e: EFEMP2; Figura 10f: GGF; Figura 10g: INHBA; Figura 10h: IGFBP7; Figura 10i: KLK10; Figura 10j: LEPRE1; Figura 10k: LUM; Figura 10l: LOXL2; Figura 10m: MMP12; Figura 10n;TIMP1; Figura 10º: ASAH1; Figura 10p: SPP1; Figura 10q SFRP2; Figura 10r. SFRP4; Figura 10s: SPARC; Figura 10t: PRSS11;

Figura 10u: THBS2: Figura 10v: TG; Figura 10w: TGFBI; Figura 10x: CGR11; Figura 10y: SERPINH1; Figura 10z: MMP2; Figura 10aa: PCSK5; Figura 10ab: SERPINB5; Figura 10ac: TGFB1 y Figura 10ad: CEA (CEACAM5) . Las Figuras 11a-11ad representan gráficas del tipo tumoral (difuso (D) o intestinal (I) ) y del log2 del cambio en veces en la expresión de 29 GTM de esta invención y CEA. Figura 11a: adlicán; Figura 11 b: ASPN; Figura 11 c: CSPG2; Figura 11d, CST1, 2, 4; Figura 11e: EFEMP2; Figura 11 f: GGH; Figura 11g: INHBA; Figura 11h: IGFBP7;

Figura 11i: KLK10; Figura 11j: LEPRE1: Figura 11k: LUM; Figura 11l: LOXL2; Figura 11m: MMP12; Figura 11n: TIMP1; Figura 11º: ASAH1;... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar cáncer gástrico, que comprende:

(a) proporcionar un muestra biológica; y

(b) detectar la sobreexpresión de un miembro de la familia GTM en dicha muestra, caracterizado porque el miembro de la familia GTM es un inhibidor de la serina o cisteína proteinasa clado H (“SERPINH1)

2. Un método de la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional de comparar la cantidad de GTM presente en dicha muestra de ensayo con un valor obtenido a partir de una muestra de control de un sujeto que no tiene cáncer gástrico.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende detectar la sobreexpresión de al menos un miembro de la familia de GTM adicional seleccionado del grupo que consiste en carboxipeptidasa N, polipéptido 2, cadena de 83 kDa (CPN2) , metaloproteinasa de la matriz 12 (MMP12) , inhibina (“INHBA”) , factor de crecimiento de tipo insulina 7 (“IGFBP7”) , gamma-glutamil hidrolasa (“GGH”) , proteoglicano enriquecido con leucina-prolina (“LEPRE1”) , cistatina S (“CST4”) , proteína relacionada con Frizzled secretada 4 (“SFRP4”) , asporina (“ASPN”) , regulador de crecimiento celular con dominio de mano EF 1 (“CGREF1”) , calicreína 10 (KLK10) , inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 (“TIMP1”) , proteína ácida secretada rica en cisteína (“SPARC”) , factor de crecimiento transformante, β-inducido (“TGFBI”) , proteína de la matriz extracelular de tipo fibulina que contiene EGF 2 (“EFEMP2”) , lumicán (“LUM”) , estanina (“SNN”) , fosfoproteína secretada 1 (“SPP1”) , proteoglicano de sulfato de condroitina 2 (“CSPG2”) , Nacilesfingosina amidohidrolasa (“ASAH1”) , serina proteasa 11 (“PRSS11”) , proteína relacionada con Frizzled secretada 2 (“SFRP2”) , fosfolipasa A2, grupo XIIB (“PLA2G12B”) , espondina 2, proteína de la matriz extracelular (“SPON2”) , olfactomedina 1 (“OLFM1”) , trombospondina que contiene repeticiones 1 (“TSRC1”) , trombospondina 2 (“THBS2”) , adlicán, cistatina SA (“CST2”) , enzima de tipo lisil oxidasa 2 (“LOXL2”) , tiroglobulina (“TG”) , factor de crecimiento transformante betal (“TGFB1”) , inhibidor de serina o cisteína proteinasa, clado B (“SERPINB5”) , metaloproteinasa de la matriz 2 (“MMP2”) , proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 (“PCSK5”) y proteína ligada a glicoproteína de hialuronano 4 (“HAPLN4”) .

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo detectando la sobreexpresión del mRNA de GTM, cDNA o usando un oligonucleótido complementario a al menos una porción de dicho cDNA de GTM.

5. El método de la reivindicación 4, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo usando un método qPCR utilizando un cebador directo y un cebador inverso.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo detectando la sobreexpresión de una proteína o péptido de GTM.

7. El método de la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo usando un anticuerpo dirigido contra dicho GTM.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo usando un método de inmunoensayo de tipo sándwich.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 ó 6, caracterizado porque la etapa de medición usa un ensayo ELISA.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la muestra de ensayo se obtiene de tejido, orina, fluido gástrico, suero, heces, sangre o plasma.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

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