Marcadores en la orina para la detección del cáncer de vejiga.

Método para detectar cáncer de vejiga en un sujeto, que comprende:

detectar la acumulación de un péptido o proteína marcadora de tumor de vejiga urinario o un ácido nucleico que codifica dicha proteína o péptido ("UBTM") en orina, dicha acumulación en dicho sujeto siendo superior a aproximadamente 1.2 veces la acumulación de dicho UBTM en la orina de un grupo de sujetos normales que no tienen cáncer de vejiga maligno, caracterizado porque el UBTM es la proteína 5 de unión a factor de crecimiento similar a insulina (IGFBP5).

Marcadores en la orina para la detección del cáncer de vejiga Campo de la invención

Esta invención se refiere a la detección de cáncer. Específicamente, la invención se refiere al uso de marcadores de orina en la detección de cáncer de vejiga. Todavía más específicamente, la invención se refiere al uso de marcadores oligonucleótidos, proteicos y/o anticuerpos en orina para la detección, tipado y escalado de cáncer de vejiga.

Antecedentes

Introducción

La supervivencia de los pacientes oncológicos mejora en gran medida cuando el cáncer se trata precozmente. En el caso del cáncer de vejiga, los pacientes diagnosticados en una fase precoz de la enfermedad tienen unas tasas de supervivencia a los 5 años de > 90%, en comparación con aproximadamente el 15 - 30% para los pacientes diagnosticados con la enfermedad avanzada. Por lo tanto, los desarrollos que permitan un diagnóstico precoz del cáncer de vejiga pueden dar lugar a un pronóstico mejorado para los pacientes. El método establecido para la detección del cáncer de vejiga mediante el uso de muestras de orina es una citología. Sin embargo, se sabe que la citología sólo es sensible en aproximadamente un 75 % para la detección del cáncer de vejiga invasivo, y sólo es sensible en aproximadamente un 25 % para la detección del cáncer de vejiga superficial (Lotan y Roehrborn, Urology 61, 109- 118 (2003)).

El cáncer de vejiga se divide ampliamente en dos clases, invasivo y superficial. El tipo invasivo penetra en las capas de tejido subyacente, mientras que el tipo superficial tiende a desarrollarse principalmente en forma de un pólipo que crece en la luz de la vejiga.

La identificación de marcadores específicos para el cáncer en la orina puede proporcionar una metodología valiosa para el diagnóstico precoz del cáncer, dando lugar a un tratamiento precoz y a un pronóstico mejorado. Los marcadores específicos del cáncer también proporcionan un medio para monitorizar la progresión de la enfermedad, permitiendo monitorizar la eficacia de los tratamientos quirúrgicos, radioterapéuticos y quimioterapéuticos. Sin embargo, para diversos cánceres importantes, los marcadores disponibles adolecen de una sensibilidad y una especificidad insuficientes.

Actualmente el método más fiable para la detección del cáncer de vejiga es la cistoscopia acompañada por una histología de las lesiones biopsiadas. Sin embargo, esta técnica es larga, invasiva y su sensibilidad es sólo de aproximadamente el 90 %, lo que significa que aproximadamente el 10 por ciento de los cánceres no son detectados mediante el uso de estos métodos. De entre las metodologías no invasivas, la citología en orina, que detecta las células malignas exfoliadas microscópicamente, es el método preferido actualmente. Aunque la citología tiene una especificidad de aproximadamente el 95 %, tiene una baja sensibilidad (del 9-25 %) para las lesiones de bajo grado, es extremadamente dependiente de la calidad de la muestra y adolece de una elevada variabilidad entre observadores.

Más recientemente se han realizado intentos para detectar marcadores genéticos en las biopsias de vejiga. El método usado más habitualmente es el análisis con micromatriz, en el que se expone una matriz que contiene oligonucleótidos complementarios a las porciones de un posible marcador genético, a una muestra de ARNm o de ADNc obtenida a partir de la muestra del paciente. Mediante el uso de estos métodos, numerosos informes recientes han identificado diversos posibles marcadores para el cáncer de vejiga. Sin embargo, la tecnología de matriz es relativamente no cuantitativa y es muy variable.

La detección de marcadores en sangre o en orina que indiquen la presencia de cáncer de vejiga proporciona un potencial método para la detección mejorada de esta enfermedad. Aunque se han realizado pocos progresos en el desarrollo de marcadores sanguíneos para el cáncer de vejiga, hay disponibles varios marcadores de proteínas en orina. Los ensayos de estos marcadores ofrecen una mejor sensibilidad que la citología pero tienden a adolecer de una especificidad subóptima debido a que los elevados niveles de estos marcadores también se observan habitualmente en los pacientes con enfermedades no malignas, que incluyen inflamación, urolitiasis e hiperplasia prostética benigna. Por ejemplo, NMP22, que detecta una proteína de la matriz nuclear específica, tiene una sensibilidad del 47 - 87 % y una especificidad del 58 - 91 %. La elevada variabilidad del NMP22 significa que no es ideal para una detección fácil y rápida del cáncer de vejiga.

Otros ensayos en orina incluyen la amplificación mediante una RT-PCR de los transcritos génicos, tales como la enzima telomerasa hTERT a partir de sedimentos celulares de muestras de orina. Los ensayos de RT-PCR ofrecen el potencial de una elevada sensibilidad, aunque la especificidad de los marcadores existentes para la RT-PCR sigue sin estar clara. US2004/0038207 describe genes expresados diferencialmente en células tumorales de vejiga.

Existe la necesidad de otras herramientas para la detección y diagnóstico tempranos de cáncer. Esta divulgación proporciona métodos, composiciones, kits y dispositivos adicionales basados en marcadores del cáncer, específicamente en marcadores del cáncer de vejiga, para ayudar tanto en la detección como el diagnóstico precoz del cáncer.

Resumen de la invención

Mediante el uso de una combinación de un análisis con micromatriz y una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), hemos sido capaces de identificar marcadores genéticos específicos que son selectivos para el cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, hemos averiguado los marcadores que pueden usarse para diferenciar la fase de un tumor de vejiga, y en otras formas de realización, hemos identificado los marcadores que pueden distinguir los tipos de tumores. En otras formas de realización, hemos averiguado inesperadamente que las combinaciones de dos o más marcadores pueden proporcionar una detección altamente fiable y sensible del cáncer de vejiga. En otras formas de realización adicionales más, hemos identificado marcadores que son muy expresados por las células del cáncer de vejiga pero no por las células sanguíneas. Por lo tanto, en muchas formas de realización, los ensayos del cáncer de vejiga son inesperadamente mejores que los ensayos de la técnica anterior.

En ciertas formas de realización, se usa un análisis con micromatriz para identificar los genes que son altamente expresados en el tejido tumoral de vejiga en comparación con un tejido de vejiga no maligno. Estos genes, y las proteínas codificadas por esos genes, se denominan en el presente documento marcadores tumorales de vejiga (BTM). Debe apreciarse que el término BTM no requiere que el marcador sea específico únicamente para los tumores de vejiga. Más bien, la expresión de los BTM puede estar aumentada en otros tipos de tumores, incluyendo los tumores malignos. También debe entenderse que los BTM incluyen marcadores que no son altamente expresados en las células sanguíneas. En virtud de la toma de muestras de la orina, la expresión de otros tipos de células habitualmente presentes en las muestras de biopsias de la técnica anterior no están presentes. El término BTM también incluye combinaciones de marcadores individuales que son útiles para la detección del cáncer de vejiga.

En otras formas de realización, se proporcionan métodos para la identificación de la presencia de marcadores en muestras, que incluyen una inmunohistoquímica y una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Los métodos de qPCR tienen una menor tendencia a los artefactos que son habituales en los análisis con micromatriz. Dichos artefactos incluyen diferencias en el número de oligonucleótidos del ligando colocados en los puntos de la matriz, una unión no uniforme e impredecible de los colorantes a los oligonucleótidos hibridados en un punto de la matriz, un lavado no uniforme de los materiales no específicos de los puntos de la matriz, y otros problemas.

Algunos de los genes divulgados en el presente documento codifican proteínas que son secretadas por la célula, escindidas de la célula o liberadas desde una célula tras la muerte celular. Estos transcritos de ARNm y sus proteínas tienen la utilidad añadida como marcadores para el diagnóstico del cáncer de vejiga, o como marcadores para la monitorización de la progresión de una enfermedad establecida. Estos marcadores pueden usarse solos o combinados entre sí. Además, otros genes, transcritos de ARN y las proteínas codificadas permanecen dentro o asociadas a la célula, y pueden usarse solos o junto con los demás como marcadores en la orina.

1. Método para detectar cáncer de vejiga en un sujeto, que comprende:

detectar la acumulación de un péptido o proteína marcadora de tumor de vejiga urinario o un ácido nucleico que codifica dicha proteína o péptido ("UBTM") en orina, dicha acumulación en dicho sujeto siendo superior a aproximadamente 1.2 veces la acumulación de dicho UBTM en la orina de un grupo de sujetos normales que no tienen cáncer de vejiga maligno, caracterizado porque el UBTM es la proteína 5 de unión a factor de crecimiento similar a insulina (IGFBP5).

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho UBTM no está presente en la sangre en un grado sustancial.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende la detección de la acumulación de al menos un UBTM adicional, en el que el UBTM se elige de entre el grupo que consiste en GGH, SPP1, NRN1, SPARC, ADAMTS10, CNTN1, TI I 2, PDIR, FBN1, el producto del gen KIAA0100, CALR, ITGBL1, ELA3B, SMOC2, HEXA, IGFBP7, MFAP2, CILP, OLFM1, LUM, SEM2, PRSS11, SULF1, SERPINH1, MGP, TIMP1, EGFL6, SPAG11, SEMA3F, CDC2, MDK, TOP2A, UBE2C, STMN1, TU B A4, HIST1H1B, HMGB2, CCNA2, CDCA1, la proteína hipotética MGC5576, DEK, MLF1IP, CDCA8, la proteína hipotética FU20647, TYMS, SMC4L1, LYN, HMGB3, PTGIR, DONSON, HMMR, CLDN6, HIST1H1D, C10orf3, KNTC1, CKS1B, RRM2, HIST1H2BH, STK6, MPHOSPH1, CCNB2, GPR32, ENG, MFHAS1, HIST1H1C, AVPR2, CENPF, , el miembro g de la familia de hlstonas h4, el gen MGC27121, NP, ASPM, la proteína hipotética FU11871, LBH, NUDT1, HELLS, ASB9, MCM5, IMP-2, DKFZP566M1046, TUBA2, GAS2L3, la proteína hipotética FU12442, MCM6, DOK3, WDR18, CKAP2, KIF20A, la posible proteína fap, C6orf32, NEK2, CRY1, TGM2, DLG7, EIF2C2, DEPDC1, HIST2H4, MCM7, MTAP, KNTC2, HSPC150, SMC6L1, HIST1H2BC, ASF1B, ARH, LMNB1, la proteína hipotética FLJ10719, la proteína hipotética FU10706, MAD2L1, SLC22A2, la proteína hipotética MGC34923, SPAG5, ACVRL1, DSCR1, PRSS15, S100A9, MCM4, ST7L, PLEKHA4, EPHB1, CALD1, SMC1L1, el co-transcrito Thy-1, RAMP, FKBP11, C20orf129, HIST1H4H, CDKN3, MCAM, SNCAIP, NIPSNAP1, AP1M1, ANLN, C6orf69, TORC3, MAZ, TXNRD1, la proteína hipotética xp 096695, C22orf4, VSNL1, similar a la cadena N de 83 kDa de la carboxipeptidasa, KIAA1598, la proteína hipotética FLJ13501, DKFZP4340047, la proteína hipotética FLJ38716, similar a la proteína hipotética (región L1H3), la proteína hipotética KIAA1875, PRIM1, la proteína hipotética BC001096, MCM2, GJA3, C11orf30, similar a la proteína hipotética FU30672, THY1, LRP3, LASS2, C18orf8, ZNF81, NARF, MTHFD2, D6T, SIAT7D, MMPL1, KLK11, KPNA2, FGFR10P2, VIM, la proteína FLJ44108, PAPOLG, FHOD1, RASL12, HMGN2, PITPNM2, DER1, EPHA4, VSIG1, RGS5, la proteína KIAA1639, SH2B, PGLYRP4, CDC45L, MLSTD1, la proteína hipotética MGC11266, TNFRSF13B, NET1, LHFPL5, MX2, SPHK1, ABCG4, SERPINB2, GALNT10, LEPR, MXD4, FAPP2, NUP210, CSK, NRP1, MGAT1, el producto del gen KIAA0100, LCN7, BMP7, ADAMTS10, PM5, NOM03, CPA6, NPPC, la proteína hipotética FU23221, ERP70, GALNT14, ITIH3, PAPPA2, LOXL1, TNFRSF6B, SPARC, MSMB, CLDN6, PTMA, AVPR2, similar al transportador de creatina dependiente de sodio y de cloruro, TMEM19, la proteína hipotética xp 047287, la proteína hipotética FLJ11871, PROSC, el gen MGC27121, NQ01, CKAP4, la proteína hipotética BC001096, PDPK1, el regulador del ensamblaje del huso mitótico 1, MIRAB13, PORCN, SIX6, GJB2, la proteína FLJ35784, SLC37A3, SPRY4, LHX3, C7orf27, SLC39A1, ZNF307, MIF, BST2, PSTPIP1, SOX4, NCOA5, la proteína hipotética FU31438, ODD, SLC23A2, SHFM1, SRPK2, RAMP2, BPGM, RGS5, CXADR, MEIS2, TENS1, SNAI2, CHST2, HCA127, el co-transcrito Thy-1 (LOC94105), LRFN3, la proteína hipotética FU22390, TRIB2, KRTHA3B, KIF21A, ANKRD17, RAG1, NUBP2, la proteína hipotética FLJ20489, CASK, HIP1, PRKCDBP, TIE, C5orf15, CGI-72. ENTPD8, SH3BGRL3, el homólogo de la subunidad MLRQ de la óxidorreductasa de NADH:ubiquinona, VG5Q, BG1, BCL2L11, ARK5, TLE3, ITIH5, RGS11, TM7SF3, SCRN3, PLXNA1, GJA4, la proteína hipotética DKFZp434G1415, WSB2. CDA, GART, ZMPSTE24, TMEM33, GPI, la proteína hipotética FLJ11000, CAMK1D, PTPN21 y TNS.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha etapa de detección se lleva a cabo mediante la detección de la acumulación de ARNm de UBTM o de un marcador de tumor de vejiga urinaria ("UBTM").

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha detección se lleva a cabo mediante el uso de una micromatriz.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha detección se lleva a cabo mediante el uso de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o de métodos de hibridación.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha etapa de detección se lleva a cabo detectando la acumulación de una proteína UBTM.

8. El método de la reivindicación 7, en el que dicha etapa de detección se lleva a cabo detectando la acumulación de un péptido UBTM.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en el que dicha etapa de detección se lleva a cabo usando un anticuerpo para UBTM.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el método incluye la detección de la acumulación

de dos o más UBTM en dicha muestra.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además la detección de uno o más pares de marcadores seleccionados del grupo que consiste en TOP2A-HOXA13, TOP2A-IGFBP5, TOP2A-SEMA3F y CDC2-HOXA13.

12. Un método para la detección de cáncer de vejiga, que comprende:

detectar la acumulación de una combinación de marcadores tumorales de vejiga urinaria (UBTMs) seleccionados del grupo que consiste en CDC2-TOP2a-IGFP5, TOP2a-IGFBP5-CHGA, CDC2-IGFP5-CHGA, CDC2- IGFP5- CHGA, TOP2a-NRP1-IGFBP5, CDC2-NRP1-IGFBP5, TOP2a-SPAG5-IGFBP5, TOP2a-ENG-IGFBP5, CDC2- SPAG5-IGFBP5, CDC2-ENG-IGFBP5, TOP2a-SEM2-IGFBP5, CDC2-SEM2, IGFBP5, HOXA13-TOP2a-IGFBP5, HOXA13-CDC2-IGFBP5, TOP2a-MDK-IGFBP5, y CDC2-MDK-IGFBP5, en una muestra de orina de un paciente sospechoso de tener cáncer de vejiga, dicha acumulación de cada uno de dichos marcadores siendo mayor a 1.2 veces la acumulación de cada uno de dichos marcadores en un grupo de sujetos normales que no tienen cáncer de vejiga maligno.

13. Un método para la detección de la presencia de cáncer de vejiga en un sujeto, que comprende:

determinar, en una muestra de orina, la cantidad de IGFBP5 en combinación con uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en BIRC2, HOXA13, MGP, NOV, NRP1, SEMA3F, SPAG5, TOP2A, y en el que dicho marcador no está sustancialmente presente en la sangre de dicho sujeto.

14. Un método para distinguir una enfermedad de vejiga maligna de una enfermedad de vejiga no maligna, que

comprende:

determinar en la orina de dicho paciente la acumulación de IGFBP5 en combinación de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en HOXA13, MDK, MGP, NRP1, SEMA3F, SMC4L1, TOP2A y UBE2C; y determinar la relación de expresión de IGFBP5 con respecto dicho uno o más marcadores en dicha muestra, la relación estando asociada a la presencia de cáncer.

15. Un método para determinar la eficacia de una terapia para el cáncer de vejiga que comprende detectar la acumulación de la proteína 5 de unión a factor de crecimiento similar a Insulina (IGFBP5) en una primera muestra de orina de un paciente, y compararla con la cantidad de dicho IGFBP5 en una segunda muestra de orina de un paciente después de un periodo de tratamiento, siendo la cantidad de dicho marcador después de dicho periodo de tratamiento menor que la cantidad de dicho marcador antes del tratamiento.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende detectar la cantidad de al menos un marcador adicional elegido de entre el grupo que consiste en GGH, SPP1, NRN1, SPARC, ADAMTS10, CNTN1, TLL2, PDIR, FBN1, el producto del gen KIAA0100, CALR, ITGBL1, ELA3B, SMOC2, HEXA, IGFBP7, MFAP2, CILP, OLFM1, LUM, SEM2, PRSS11, SULF1, SERPINH1, MGP, TIMP1, EGFL6, SPAG11, IGFBP5, SEMA3F, CDC2, TOP2A, UBE2C, STMN1, TUBA4, HIST1H1B, HMGB2, CCNA2, CDCA1, la proteína hipotética MGC5576, DEK, MLF1IP, CDCA8, la proteína hipotética FU20647, TYMS, SMC4L1, LYN, HMGB3, PTGIR, DONSON, HMMR, CLDN6, HIST1H1D, C10orf3, KNTC1, CKS1B, RRM2, HIST1H2BH, STK6, MPHOSPH1, CCNB2, GPR32, ENG, MFHAS1, HIST1H1C, AVPR2, CENPF, HOXA13, el miembro g de la familia de histonas h4, MGC27121 el gen, NP, ASPM, la proteína hipotética FLJ11871, LBH, NUDT1, HELLS, ASB9, MCM5, IMP-2, DKFZP566M1046, TUBA2, GAS2L3, la proteína hipotética FU12442, MCM6, DOK3, WDR18, CKAP2, KIF20A, la posible proteína fap, C6orf32, NEK2, CRY1, TGM2, DLG7, EIF2C2, DEPDC1, HIST2H4, MCM7, MTAP, KNTC2, HSPC150, SMC6L1, HIST1H2BC, ASF1B, ARH, LMNB1, la proteína hipotética FU 10719, la proteína hipotética FU10706, MAD2L1, SLC22A2, la proteína hipotética MGC34923, SPAG5, ACVRL1, DSCR1, PRSS15, S100A9, MCM4, ST7L, PLEKHA4, EPHB1, CALD1, SMC1L1, el co-transcrito Thy-1, RAMP, FKBP11, C20orf129, HIST1H4H, CDKN3, MCAM, SNCAIP, NIPSNAP1, AP1M1, ANLN, C6orf69, TORC3, MAZ, TXNRD1, la proteína hipotética xp 096695, C22orf4, VSNL1, similar a la cadena N de 83 kDa de la carboxipeptidasa, KIAA1598, la proteína hipotética FLJ13501, DKFZP4340047, la proteína hipotética FU38716, similar a la proteína hipotética (región L1H3), la proteína hipotética KIAA1875, PRIM1, la proteína hipotética BC001096, MCM2, GJA3, C11orf30, similar a la proteína hipotética FLJ30672, THY1, LRP3, LASS2, C18orf8, ZNF81, NARF, MTHFD2, D6T, SIAT7D, MMPL1, KLK11, KPNA2, FGFR10P2, VIM, la proteína FU44108, PAPOLG, FHOD1, RASL12, HMGN2, PITPNM2, DER1, EPHA4, VSIG1, RGS5, la proteína KIAA1639, SH2B, PGLYRP4, CDC45L, MLSTD1, la proteína hipotética MGC11266, TNFRSF13B, NET1, LHFPL5, MX2, SPHK1, ABCG4, SERPINB2, GALNT10, LEPR, MXD4, FAPP2, NUP210, CSK, NRP1, MGAT1, el producto del gen KIAA0100, LCN7, BMP7, ADAMTS10, PM5, NOM03, CPA6, NPPC, la proteína hipotética FU23221, ERP70, GALNT14, ITIH3, PAPPA2, LOXL1, TNFRSF6B, SPARC, MSMB, CLDN6, PT- MA, AVPR2, similar al transportador de creatina dependiente de sodio y de cloruro, TMEM19, la proteína hipotética xp 047287, la proteína hipotética FU11871, PROSC, MGC27121 el gen, NQ01, CKAP4, la proteína hipotética BC001096, PDPK1, el regulador del ensamblaje del huso mltótlco 1, MIRAB13, PORCN, SIX6, GJB2, la proteína FLJ35784, SLC37A3, SPRY4, LHX3, C7orf27, SLC39A1, ZNF307, MIF, BST2, PSTPIP1, SOX4, NCOA5, la proteína hipotética FLJ31438, ODD, SLC23A2, SHFM1, SRPK2, RAMP2, BPGM, RGS5, CXADR, MEIS2, TENS1, SNAI2, CHST2, HCA127, el co-transcrito Thy-1 (LOC94105), LRFN3, la proteína hipotética FU22390, TRIB2, KRTHA3B,

KIF21A, ANKRD17, RAG1, NUBP2, la proteína hipotética FU20489, CASK, HIP1, PRKCD- BP, TIE, C5orf15, CGI- 72. ENTPD8, SH3BGRL3, el homólogo de la subunidad MLRQ de la óxidorreductasa de NADH:ubiquinona, VG5Q, BG1, BCL2L11, ARK5, TLE3, ITIH5, RGS11, TM7SF3, SCRN3, PLXNA1, GJA4, la protema hipotética DKFZp434G1415, WSB2. CDA, GART, ZMPSTE24, TMEM33, GPI, la proteína hipotética FLJ11000, CAMK1D, 5 PTPN21 y TNS, en una primera muestra de un paciente, y compararla con la cantidad de dicho uno o más marcadores en una segunda muestra de un paciente después de un periodo de tratamiento, siendo la cantidad de dicho marcador después de dicho periodo de tratamiento menor que la cantidad de dicho marcador antes del tratamiento.