Un método para pronóstico y/o diagnóstico de trisomía 21 (síndrome de Down) en fetos que incluye:

a. la detección cuantitativa de la proteína componente de amiloide P en suero (SAP, SAMP, Swiss Prot No: P02743) en sangre periférica, suero y/o plasma de una mujer embarazada, y b. la comparación del valor cuantitativo de esa proteína obtenido en la fase (a) con el valor cuantitativo de esa proteína en el mismo líquido biológico de mujeres portadoras de fetos cromosómicamente normales. c. el pronóstico y/o diagnóstico es positivo si el valor cuantitativo de la proteína componente de amiloide P en suero (SAP, SAMP, Swiss Prot No: P02743), es mayor que el valor cualitativo de esa proteína en el mismo líquido biológico de mujeres portadoras de fetos cromosómicamente normales

B. Campo de la invención

La presente invención se refiere a la proteína componente de amiloide P de suero (SAP, SAMP) que se podría convertir en una diana y usarse como un marcador para el diagnóstico prenatal y evaluación de la trisomía 21 (síndrome de Down) por métodos no invasivos. Más específicamente, en la sangre periférica de mujeres embarazadas de fetos con trisomía 21 (síndrome de Down), se encuentra que el componente del amiloide P en suero (SAP, SAMP) muestra diferencias cuantitativas comparadas con embarazadas con fetos cromosómicamente normales.

C. Antecedentes de la invención

Hoy la metodología usada para el diagnóstico prenatal de anormalidades cromosómicas fetales incluye técnicas invasivas y no invasivas. Los procedimientos invasivos (amniocentesis, biopsia del trofoblasto y sangre fetal) tienen un riesgo significativo para la madre y el feto y por esta razón solo se recomiendan en mujeres embarazadas en las que el riesgo de tener un hijo cromosómicamente anormal es mayor que el riesgo de pérdida fetal debido a la técnica invasiva.

Puesto que el riesgo para anormalidades cromosómicas aumenta con la edad materna, el diagnóstico prenatal está recomendado para mujeres mayores de 35 años de edad. Como resultado, nacen menos niños con síndrome de Down de mujeres mayores. Sin embargo, el 70% de los niños con esta anormalidad cromosómica nacen de mujeres de 35 años de edad para las que no está recomendado el diagnóstico prenatal. Los métodos de diagnóstico prenatal no invasivos usados de forma rutinaria hoy para anormalidades cromosómicas están recomendados para embarazos de poco riesgo. Estos métodos incluyen marcadores tanto bioquímicos como ultrasonográficos que se usan después de una estimación algorítmica solo para evaluar el riesgo de anormalidades cromosómicas. En casos con marcadores bioquímicos o ultrasonográficos anormales se recomienda investigación adicional mediante diagnóstico prenatal invasivo. Además, estos marcadores no son específicos para la trisomía 21 y están asociados con una tasa de detección de falsos positivos del 5%, lo que produce un aumento en el número de mujeres que se someten a diagnóstico prenatal.

La nuevas técnicas no invasivas para el diagnóstico prenatal basadas en el aislamiento de células fetales o ADN fetal sin células de sangre periférica materna parecen ser difíciles de aplicar en la práctica clínica debido a la falta de las características específicas para distinguir entre material fetal y materno. En la actualidad, el análisis proteómico se usa ampliamente para la detección de marcadores biológicos relacionados con enfermedades. Esta tecnología puede usar todos los tipos de líquidos y tejidos biológicos así como sangre periférica, lo que produce el desarrollo de pruebas clínicas rápidas, exactas y económicas que pueden alterar drásticamente los procedimientos diagnósticos y planteamientos terapéuticos actuales.

Un número limitado de datos publicados sobre el análisis proteómico del líquido amniótico y sangre periférica de mujeres embarazadas está relacionado con la detección de proteínas y péptidos durante la gestación como resultado de las alteraciones moleculares a nivel de ADN o ARN [documento WO2005/0217 A (Pantharhei Biosciencies BV [NL] et al)]. Estos estudios muestran que el análisis proteómico es un planteamiento versátil para la detección de marcadores relacionados con afecciones patológicas durante el embarazo y estas proteínas/péptidos se pueden usar como marcadores de estas afecciones.

Estudios de los cerebros de fetos y adultos con síndrome de Down mostraron alteraciones de enzimas que participan en el metabolismo de glucosa, lípidos, purinas, ácido fólico y metionina, N-metiltransferasa de histamina disminuida, y alteraciones en la expresión de PRXIII del cerebro, lo que implica que más de un gen codifica proteínas relacionadas con el fenotipo del síndrome. En la presente invención se detectó e identificó una proteína, que como total o fragmentos de su secuencia, pueden ser dianas y usarse originalmente como marcador para el diagnostico prenatal no invasivo del síndrome de Down, de todas las mujeres independientemente del riesgo de tener feto cromosómicamente anormal.

D. Descripción de la invención

Se analizaron muestras de plasma de sangre periférica obtenidas de mujeres embarazadas que portaban fetos con trisomía 21 (síndrome de Down) y de casos que los portaban cromosómicamente normales usando técnicas proteómicas como se describe en detalle a continuación.

Métodos

El análisis proteómico incluye separación de proteínas por electroforesis en gel bidimensional e identificación de proteínas por espectrometría de masas. El procedimiento de identificación de proteínas, aparte de las técnicas analíticas, incluye software específico que se usa para analizar los geles bidimensionales y para almacenar la información obtenida en bases de datos.

A. Separación de proteínas mediante electroforesis en geles bidimensionales

La técnica se basa en la separación simultánea de proteínas por su carga y peso molecular lo que produce el aislamiento en el gel de cientos de proteínas. De esta manera, tal estudio incluye la separación de proteínas por su carga (isoelectroenfoque, IEF) seguido por separación adicional basada en su peso molecular.

El IEF es un procedimiento de equilibrio por el cual las proteínas se mueven por la acción de un campo eléctrico de alto voltaje, a través de un gel de acrilamida con pH diferencial, que contiene inmovilinas (recubrimiento de tiras IPG). Durante su movimiento a través de la tira las proteínas se estabilizan y enfocan en áreas de la tira en la su carga se neutraliza. Las tiras IPG están disponibles en un gran intervalo de pH (tal como 3-10) y tamaño (7-24 cm), así como a intervalos de pH más cerrados (tal como 4,5-5,5). Las tiras IPG tienen la ventaja de analizar una cantidad relativamente alta de muestra. Las condiciones de electroforesis para el IEF están relacionadas con la cantidad de la muestra, el método usado para la aplicación de la muestra en la tira, el voltaje y tiempo del enfoque.

En la segunda dimensión, la separación de proteínas se basa en el peso molecular. Tiene lugar en un gel de poliacrilamida constante o en gradiente dependiendo del tamaño aproximado de las proteínas. Normalmente se usan geles constantes de acrilamida al 12% y gradientes de acrilamida del 9-16% para la separación de proteínas entre 5200 kDa.

Por último, los geles se tiñan con colorantes. Normalmente se selecciona azul de Coomassie cuando las proteínas se tienen que identificar adicionalmente por espectrometría de masa.

Dada la heterogeneidad de las proteínas, cada proteína puede estar representada en el gel bidimensional por más de una mancha, lo que produce la identificación de un número mayor de productos génicos (proteínas) que el de los genes codificados. En eucariotas, se sabe que de 5-20 proteínas pueden estar traducidas por el mismo gen.

B. Espectrometría de masa

Después de la separación por electroforesis en geles bidimensionales, las proteínas se identifican mediante 1) espectrometría de masa (desorción-ionización de laser asistida por matriz, MALDI-TOF-EM) o 2) técnicas de espray iónico.

Las manchas de proteínas se cortan del gel de acrilamida, se destiñen y tratan con tripsina. Todos los péptidos que derivan de todas las manchas se recogen y analizan por espectrometría de masa y determinación de la secuencia de aminoácidos de cada péptido. Se usa un software sofisticado para comparar las masas de los péptidos detectados a las masas teóricas de todos los conjuntos de datos de proteínas disponibles de todas las especies. La identificación de las proteínas normalmente se basa en la detección de más de cinco péptidos que se ajustan para cada proteína (algunas veces se ajustan hasta veinte péptidos en casos de grandes moléculas de proteínas). De este modo la tasa de detección falsa se estima que es menos de 10-6 .

La técnica de espray iónico puede proporcionar resultados seguros en la secuenciación de aminoácidos de péptidos con una probabilidad de tasa de falsos positivos de menos de 10-10, relacionado con el número de péptidos usados para el análisis.

En conclusión, la técnica de MALDI-TOF-EM permite el análisis rápido de un gran número de manchas de proteínas. Sin embargo, la técnica de espray iónico es más fiable... [Seguir leyendo]

1. Un método para pronóstico y/o diagnóstico de trisomía 21 (síndrome de Down) en fetos que incluye:

a. la detección cuantitativa de la proteína componente de amiloide P en suero (SAP, SAMP, Swiss Prot No: P02743) en sangre periférica, suero y/o plasma de una mujer embarazada, y

b. la comparación del valor cuantitativo de esa proteína obtenido en la fase (a) con el valor cuantitativo de esa proteína en el mismo líquido biológico de mujeres portadoras de fetos cromosómicamente normales.

c. el pronóstico y/o diagnóstico es positivo si el valor cuantitativo de la proteína componente de amiloide P en suero (SAP, SAMP, Swiss Prot No: P02743), es mayor que el valor cualitativo de esa proteína en el mismo líquido biológico de mujeres portadoras de fetos cromosómicamente normales.

2. Un método que, según la reivindicación 1, se caracteriza por la detección de la proteína componente de amiloide P en suero (SAP, SAMP, Swiss Prot No: P02743) completa o de la proteína modificada como resultado de modificaciones postraduccionales.

3. Un método que, según la reivindicación 1 o 2, se caracteriza por el hecho que el resultado para el pronóstico y/o diagnóstico es positivo si la cantidad de proteína componente de amiloide P en suero (SAP, SAMP, Swiss Prot No: P02743) o de la proteína modificada es mayor que su cantidad mencionada como normal.

4. Un método que, según las reivindicaciones 1 a 3, se caracteriza por el hecho de que el resultado para el pronóstico y/o diagnóstico es positivo si la cantidad de proteína componente de amiloide P en suero (SAP, SAMP, Swiss Prot No: P02743) o de la proteína modificada es mayor que su cantidad en el mismo líquido biológico de mujeres portadoras de un feto normal.

5. Un método que, según las reivindicaciones 1 a 4, se caracteriza por el hecho de que el resultado para el pronóstico y/o diagnóstico es positivo si la cantidad de proteína componente de amiloide P en suero (SAP, SAMP, Swiss Prot No: P02743) o de la proteína modificada es mayor que la cantidad de una proteína de referencia.

6. Un método que, según cada una de las reivindicaciones 1 a 5, se caracteriza por el hecho de que el análisis cuantitativo se realiza usando uno de los siguientes métodos: nanotecnología, electroforesis nanocapilar en un microchip, electroforesis (de una o dos dimensiones), inmunotransferencia, microtitulación (ELISA simple y/o múltiple), cromoatografía (HPLC, LC, nanoLC, GC, etc.), espectrometría de masa [huella de masa de péptidos, descomposición posfuente, MALDI EM, MALDI EM-EM, LC-EM, LC-EM-EM, TANDEM-EM, TANDEM EM-EM, SELDI EM, etc.] o combinación de estas técnicas.

7. Un método que, según cada una de las reivindicaciones 1 a 6, se caracteriza por el hecho de que el análisis cuantitativo se realiza usando sustancias fluorescentes o isótopos o anticuerpos u oligonucleótidos o una combinación de estas sustancias.

8. El uso de la proteína componente de amiloide P en suero (SAP, SAMP, Swiss Prot No: P02743) para el pronóstico y/o diagnóstico de la trisomía 21 (síndrome de Down) durante el embarazo.

9. El uso, según la reivindicación 8, de la proteína componente de amiloide P en suero (SAP, SAMP, Swiss Prot No: P02743) o de la proteína modificada, para el pronóstico y/o diagnóstico de la trisomía 21 (síndrome de Down) durante el embarazo por métodos no invasivos.