DIAGNÓSTICO DE LA PREECLAMPSIA.

La preeclampsia es un trastorno hipertensivo que complica hasta el 6-8% de embarazos, y sigue siendo la causa principal de morbimortalidad materna y perinatal (1, 2). No obstante, a pesar de los amplios esfuerzos de investigación, la etiología de este trastorno multisistemático todavía sigue estando incomprendida completamente. Parece que la activación endotelial vascular, seguida de vasoespasmos, es el rasgo central en la patogénesis de la preeclampsia. Las teorías de esta causa incluyen implantación y desarrollo anormal de la placenta, estrés oxidativo, homeostasia de prostanoides y óxido nítrico endotelial alterada, polimorfismos genéticos, autoanticuerpos circulantes anormales, y una respuesta inflamatoria sistemática materna anormal (3, 4, 5, 6, 7). Más recientemente, ha habido un foco creciente sobre los efectos de las variaciones en los niveles de expresión de moduladores de angiogénesis, que provocan síntomas de preeclampsia, incluyendo hipertensión, proteinuria, activación de células endoteliales y aumento de la agregación plaquetaria (8, 9, 10, 11, 12). Específicamente, estudios recientes han dado a conocer que las concentraciones séricas maternas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), del factor de crecimiento placentario (PIGF) y tirosina cinasa-1 similar a fms soluble (sFlt-1) están alteradas en pacientes con preeclampsia clínica (13, 14, 15). VEGF y PIGF son factores de crecimiento implicados en el desarrollo placentario, y ambos contribuyen a la actividad mitogénica y a la angiogénesis que es crucial para un feto en desarrollo. sFlt-1 es una variante de corte y empalme del receptor de Flt- 1. Carece de los dominios citoplásmicos y transmembránicos de Flt-1, un receptor que se une tanto a VEGF como a PIGF, activando sus rutas de señalización. El aumento de sFlt-1 sérico precede al comienzo de preeclampsia clínicamente identificable en aproximadamente 5 semanas, y la reducción de PIGF libre es evidente tan pronto como el primer trimestre (13, 15, 16). Por el contrario, las concentraciones séricas de VEGF son bajas durante el embarazo en mujeres con preeclampsia clínica (15). También parece que tales factores angiogénicos son significativos en la regulación de la fisiología vascular glomerular renal humana. sFlt-1 exógeno, administrado a roedores preñados, conduce a hipertensión, proteinuria y endoteliosis glomerular (17). De forma similar, la neutralización de VEGF, un factor de supervivencia mitogénico, clave para el endotelio vascular glomerular, conduce a apoptosis incrementada, reparación capilar glomerular alterada, y proteinuria importante (18). En preeclampsia grave, la endoteliosis glomerular, una característica habitual del trastorno, da soporte a la relación entre los factores angiogénicos alterados en pacientes con trastornos hipertensivos y la función renal general (19, 20, 21, 22, 23). Actualmente, no hay un único ensayo para predecir o diagnosticar la preeclampsia, o para pronosticar la gravedad de la afección que se desarrollará en un paciente particular. Los síntomas tempranos incluyen cefaleas persistentes, visión borrosa, o sensibilidad a la luz y dolor abdominal. Sin embargo, un diagnóstico de la preeclampsia no se realiza típicamente hasta que se revela una tensión arterial elevada y proteína en la orina (proteinuria), típicamente en ensayos médicos rutinarios tras la 20ª semana de embarazo (1). Los efectos graves de la preeclampsia, incluyendo ataques, hemorragia cerebral, coagulación intravascular diseminada e insuficiencia renal, pueden aparecer muy poco después tras tal diagnóstico. Estos métodos son imprecisos y proporcionan poca comprensión sobre la probabilidad del desarrollo de síntomas más graves. Además, los diagnósticos actuales requieren la inadvertencia médica y metodologías invasivas, retrasando y complicando adicionalmente la evaluación temprana e inmediata. Se necesita un método temprano y exacto para la detección y diagnóstico de preeclampsia y trastornos hipertensivos proteinúricos asociados. El documento WO 2004/008946 (Karumanchi et al.) enseña métodos para tratar preeclampsia y eclampsia usando compuestos que incrementan los niveles de VEGF o PIGF, o compuestos que disminuyen los niveles de sFlt-1. El documento WO 98/28006 (Charnock-Jones et al) enseña un método para tratar un trastorno hipertensivo administrando una sustancia que regula la cantidad y/o actividad de VEGF. El documento WO 2007/053161 (Karumanchi et al) enseña métodos para diagnosticar o tratar trastornos hipertensivos relacionados con el embarazo, que incluyen el uso de un polipéptido o un ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado de una variedad de productos génicos segregados aumentados supuestamente en mujeres con preeclampsia. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para diagnosticar a una mujer embarazada que tiene, o que es susceptible de desarrollar, un trastorno hipertensivo, que comprende medir los niveles de tirosina cinasa 1 similar a fms soluble (sFlt-1) en una muestra de orina obtenida de la mujer embarazada, en el que un nivel de sFlt-1 mayor que 9,5 picogramos por miligramo de creatinina urinaria es un indicador diagnóstico de preeclampsia, y en el que un nivel de sFlt-1 mayor que 40 picogramos por miligramo de creatinina urinaria es un indicador diagnóstico de 2 E05857213 03-11-2011   preeclampsia grave. Se teorizó que los desajustes funcionales y morfológicos del riñón materno asociados con preeclampsia indican que las alteraciones en los niveles de sFlt-1, VEGF y PIGF urinarios pueden agrupar trastornos hipertensivos, y pueden diferenciar a mujeres embarazadas con preeclampsia grave de controles embarazadas normotensas. Mientras varios artículos suficientemente publicados han dado a conocer que niveles aumentados de sFlt-1 circulante y PIGF y VEGF reducidos en suero pueden predecir el comienzo de preeclampsia, la excreción urinaria de estos factores antiangiogénicos no se ha estudiado previamente en profundidad, ni se ha analizado el efecto específico de tales niveles de secreción en el contexto de la gravedad de las enfermedades. La presente invención proporciona la monitorización y uso de niveles de sFlt-1, VEGF y PIGF en muestras de orina como un indicador diagnóstico de trastornos hipertensivos, incluyendo preeclampsia. Además, la invención proporciona un método no invasivo para diferenciar preeclampsia grave de otros trastornos hipertensivos. Los métodos y ensayos desarrollados son simples y baratos, y se pueden utilizar tan pronto como el primer trimestre de embarazo, incrementando así la probabilidad de una detección y tratamiento tempranos. Además, esta invención se describe con referencia a mujeres embarazadas, los métodos descritos aquí también se pueden utilizar para evaluar el riesgo de mujeres no embarazadas a desarrollar trastornos hipertensivos durante el embarazo. En una realización, la invención proporciona un método para diagnosticar o ayudar a diagnosticar si una mujer embarazada tiene, o tiene propensión a desarrollar, un trastorno hipertensivo midiendo la concentración de sFlt-1 en una muestra de orina obtenida del sujeto de ensayo, y comparando la concentración con un patrón apropiado. El patrón puede ser, por ejemplo, la concentración de sFlt-1 en orina obtenida de mujeres embarazadas cuyos embarazos son normales, o de mujeres embarazadas que tienen un trastorno hipertensivo confirmado, incluyendo preeclampsia. Tales sujetos se denominan como sujetos de referencia. Las muestras de referencia se obtienen de sujetos de referencia quienes, cuando se obtiene la muestra, están en la semana de embarazo correspondiente a aquella semana de embarazo en la que está la sujeto de ensayo cuando se obtiene la muestra de ensayo. Las muestras de referencia se pueden obtener y analizar en el mismo momento en que las muestras de orina se obtienen de los sujetos de ensayo. Como alternativa, se puede utilizar un patrón establecido (un patrón previamente establecido, o uno desarrollado tras la evaluación de la muestra de orina obtenida de un sujeto de ensayo). Una concentración incrementada de sFlt-1 en la orina de una mujer embarazada que se evalúa (un sujeto de ensayo), en comparación con la concentración de sFlt-1 en orina procedente de una mujer embarazada normal, indica que la mujer tiene mayor riesgo de desarrollar preeclampsia u otro trastorno o trastornos hipertensivos. Un incremento en la concentración de sFlt-1 por encima de 9,5 picogramos por miligramo de creatinina urinaria indica que la mujer embarazada tiene un mayor riesgo de desarrollar preeclampsia leve, mientras que un incremento en la concentración de sFlt-1 por encima de 40 picogramos por miligramo de creatinina urinaria indica que la mujer embarazada tiene un mayor riesgo de desarrollar preeclampsia grave. Un método para evaluar... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar que una mujer embarazada tiene, o es susceptible de desarrollar, un trastorno hipertensivo, que comprende medir los niveles de tirosina cinasa 1 similar a fms soluble (sFlt-1) en una muestra de orina obtenida de la mujer embarazada, en el que un nivel de sFlt-1 mayor que 9,5 picogramos por miligramo de creatinina urinaria es un indicador diagnóstico de preeclampsia, y en el que un nivel de sFlt-1 mayor que 40 picogramos por miligramo de creatinina urinaria es un indicador diagnóstico de preeclampsia grave. 2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra de orina se trata con un agente estabilizante antes de medir los niveles de sFlt-1. 3. El método de la reivindicación 2, en el que el agente estabilizante es un inhibidor de proteasas. 4. El método de la reivindicación 3, en el que el inhibidor de proteasas es uno cualquiera de los siguientes, o una combinación de los mismos: AEBSF, Pefabloc SC, fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo, antipaína, hidrocloruro de antipaína, aprotinina, benzamidina, hidrocloruro de benzamidina, bestatina, quimostatina, E-64, Ltrans-epoxisuccinil-leucinamida-(4-guanido)-butano, N-[N-(L-trans-carboxioxiran-2-carbonil)-L-leucil]-agmatina), ácido etilendiaminotetraacético y su sal sódica, leupeptina, N-etilmaleimida, pepstatina, pepstatina A, fosforamidón, azida sódica, inhibidor de tripsina y ácido -aminocaproico. 5. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la medición se lleva a cabo usando un ensayo inmunológico. 6. El método de la reivindicación 5, en el que el ensayo inmunológico es un ELISA. 16 E05857213 03-11-2011   P-CTR (n=16) pHTN (n=21) sPE (n=17) Valor de p Características maternas Edad: años, media [95%CI] 26,4 [23,7-29,1] 29,8 [27,2-32,3] 24,4 [21,6-27,2] p=0,021 Gravidez: mediana [intervalo] 2 [1-6] 2 [1-8] 1 [1-7] p=0,063 Número de partos: mediana [intervalo] 1 [0-3] 0 [0-5] 0 [0-4] p=0,250 Peso materno: kg, media [95%CI] 81,8 [74,0-89,6] 100 [84,7-115,3] 88,8 [74,8-101,6] p=0,166 28,6 [7,0-39,0] 34,4 [16,6-40,4] 31,3 [24,1-40,2] p=0,304 Edad gestacional: semanas, mediana [intervalo] reclutamiento 38,5 [37,4-39,6] 34,4 [32,4-36,6] 32 [29,5-1-34,4] p=0,003 Edad gestacional: semanas, mediana [intervalo] parto Características fetales Peso del nacido: g, media [95%CI] 3355 [3093-3617] 2105 [1593-2617] 1622 [1095-2150] p=0,001 Manifestaciones clínicas 17 TA sistólica: mmHg, media [95%CI] 105,5 [99,1-111,9] 160,0 [149,7-170,4] 162,4 [155,7-169,2] p<0,001 TA diastólica: mmHg, media [95%CI] 64,4 [58,9-70,0] 94,6 [89,0-100,3] 101,5 [94,4-108,6] p<0,001 Síntomas neurológicos n [%] 0,0 [0,0] 3,0 [14,3] 7,0 [41,2] p=0,0081 ¶ El dato se analizó mediante ANOVA de una vía (), ANOVA de Kruskal-Wallis (), Chi cuadrado (¶) Figura 1   pHTN (n=21) sPE (n=17) Valor de p Ensayos clínicos de laboratorio Proteinuria en tira reactiva: mediana [intervalo] 1,5 [0-4] 3 [1-4] p<0,001 § Proteinuria 24-h: g/dl, mediana [intervalo] 0,9 [0,1-13,1] 3,0 [0,7-5,4] p=0,109 § AST:U/l mediana [intervalo] 20,0 [8,0-59,0] 26,0 [5,0-1380,0] p=0,166 § ALT:U/l mediana [intervalo] 14,0 [4,0-32,0] 25,0 [9,0-550,0] p=0,010 § plaquetas: células/ulx10 3 media [95%CI] 263,3 [221,5-305,1] 194,3 [149,2-239,4] p=0,035 ¥ LDH: U/l mediana [intervalo] 204,0 [153,0-366,0] 245,0 [184,0-2940,0] p=0,015 § Ácido úrico: mg/dl, mediana [intervalo] 5,8 [5,1-6,4] 6,7 [6,2-7,3] p=0,025 § El dato se analizó mediante la prueba de Mann-Whitney (§), prueba de la t de Student (¥) 18 Figura 2   NP-CTR (n=14) P-CTR (n=16) pHTN (n=21) sPE (n=17) Valor de p 93,5 [21,2-258,6] 152,0 [26,8-488,3] 140,6 [42,3-483,5] 214,8 [17,1-817,6] p=0,019 VEGF: pg/mgc mediana [intervalo] 14,7 [7,3-21,2] 65,7 [8,5-304,1] 22,1 [6,2-255,2] 19,2 [8,0-99,2] p<0,001 PLGF: pg/mgc mediana [intervalo] 10,5 [0,4-48,1] 15,6 [0,1-65,8] 56,1 [7,6-453,5] 145,5 [6,4-990,7] p<0,001 sFLT: pg/mgc mediana [intervalo] 6,4 [4,3-9,2] 7,3 [2,4-23,4] 7,4 [5,4-32,3] 11,8 [4,3-28,7] p<0,001 Proteína: mg/mgc mediana [intervalo] 1,3 [0,3-2,5] 1,0 [0,2-2,8] 0,5 [0,1-2,0] 0,7 [0,1-1,6] p=0,032 Creatinina: mg/ml 19 mediana [intervalo] El dato se analizó mediante ANOVA de Kruskal-Wallis (); los valores se dan por mg de creatinina (mgc) Figura 3   E05857213 03-11-2011   21 Experimentos de ELISA representativos para sFlt-1 (A) y PIGF (B). Los pocillos de la izquierda muestran las curvas patrón respectivas. Los pocillos a la derecha de cada experimento muestran la inmunorreactividad de 8 muestras de orina. Los cuatro superiores (mostrados en el recuadro) proceden de 4 pacientes diferentes con preeclampsia grave (sPE), mientras que los cuatro inferiores proceden de 4 pacientes embarazadas normales (CRL).   22 C: Hoja de análisis representativa usada para el cálculo de uFP a partir del experimento en la diapositiva previa. D: uFP media (+SD) de pacientes con preeclampsia grave (sPE) frente a controles (CRL). El asterisco indica significancia estadística (p < 0,001). La línea punteada indica el corte en uFP con valor de diagnóstico para sPE a partir de nuestra publicación [Am J Obstet Gynecol. 2005 Mar, 192(3):734-41].   23 E05857213 03-11-2011   24 E05857213 03-11-2011   E05857213 03-11-2011 NP-CTR P-CTR mPE sPE Valor de p   VEGF Sangre (pg/ml) 176,6 [78,7-819,0] 1,6 [0,0-59,8] 0,2 [0,0-123,9] 0,1 [0,0-48,1] P<0,001 Orina (pg/mgc) 74,0 [5,4-116,7] 97,6 [21,4-219,3] 45,2 [7,6-231,3] 114,1 [8,2-817,6] p=0,021 sFlt-1 Sangre (pg/ml) 31,8 [20,1-64,9] 433,7 [189,0-1992,2] 1618,0 [539,4-3329,9] 2252,6 [1626,8-3328,2] p<0,001 Orina (pg/mgc) 2,4 [0,7-35,4] 1,5 [0,3-17,9] 10,9 [1,6-217,7] 81,7 [12,7-990,7] p<0,001 PIGF Sangre (pg/ml) 8,3 [5,4-10,0] 330,0 [26,2-933,7] 169,2 [46,4-805,6] 58,5 [4,6-269,8] P<0,001 Orina (pg/mgc) 9,9 [4,3-16,8] 55,8 [10,0-476,9] 13,6 [3,9-163,0] 17,3 [7,3-99,2] p=0,001 Proteínas Sangre (mg/ml) 62,8 [45,0-93,6] 60,8 [52,5-81,3] 55,7 [21,5-91,4] 48,6 [29,7-57,2] p<0,001 5,5 [3,9-8,6] 6,8 [4,5-16,3] 5,7 [2,2-24,8] 10,5 [4,0-38,5] p=0, 007 Relación de proteína/creatinina en orina (mg/mgc) 26 Albúmina Sangre (mg/ml) 23,0 ± 1,5 23,1 ± 1,5 30,8 ± 5,71 19,5 ± 1,4 p=0,235 Orina (g/mgc) 2,8 [1,3-7,2] 5,6 [1,7-21,5] 37,4 [7,8-503,6] 173,5 [52,1-3069,0] p< 0,001 Creatinina Sangre (mg/dl) 0,81 ± 0,1 0,59 ± 0,1 0,66 ± 0,1 0,80 ± 0,1 p=0,013 Orina (mg/dl) 121,5 ± 26,1 120,3 ± 11,3 136,5 ± 24,8 103,9 ± 15,7 p=0,634 El dato se analizó mediante ANOVA de una vía (), ANOVA de Kruskal-Wallis () Figura 9   27 E05857213 03-11-2011   28 E05857213 03-11-2011   29 E05857213 03-11-2011   E05857213 03-11-2011