Ensayo para determinar en un sujeto del sexo femenino la posible implantación de embriones obtenidos o que van a obtenerse por fecundación asistida,

que comprende:

(i) medir, para una pluralidad de oocitos recogidos de dicho sujeto, el nivel de factor estimulante de colonias de granulocitos del líquido folicular (G-CSF) presente en el líquido folicular (LF) de un folículo de cada oocito recogido; y

(ii) determinar a partir de los niveles de G-CSF LF medidos, las posibles implantaciones de los embriones obtenidos o que van a obtenerse por fecundación asistida de los oocitos

Ensayo y dispositivo para predecir el éxito de un implante en fertilización asistida.

La fecundación asistida, tal como la fecundación in vitro (FIV) o la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) se han usado con éxito en pacientes humanos con problemas de infertilidad durante tres décadas. A pesar de la amplia investigación, aún es un procedimiento difícil y caro y normalmente se observa una baja tasa de implantación por embrión transferido (del 15-20%).

Los hospitales y centros privados que proporcionan un servicio de fecundación asistida basan su selección después de la fecundación del oocito en características del embrión así producido. Por ejemplo, la selección puede basarse en la morfología del embrión (Guerif F et al., 2007, Hum Reprod 22 (7): 1973), o en la producción de HLA-G soluble por parte de los embriones (Fuzzi B, et al., 2002, Eur J Immunol. Feb; 32 (2): 311-5). Ambas técnicas requieren interferencia con el embrión.

Para incrementar el éxito de los embarazos, el número de embriones transferidos habitualmente es más de uno. En Europa es una práctica habitual transferir dos embriones a la cavidad uterina. En Estados Unidos este número es mayor, normalmente se transfieren tres o cuatro embriones. El efecto negativo de tal política es que aumenta el número de embarazos múltiples y las subsiguientes patologías obstétricas relacionadas, tales como prematuridad y baja tasa de nacimiento principalmente.

Además, la fecundación asistida es un procedimiento caro y puede ser también psicológicamente traumático para un paciente. Se requieren procedimientos quirúrgicos para recoger óvulos para la fecundación asistida y después de la fecundación se requiere otra cirugía para implantar los óvulos fecundados en el útero. La receptora debe entonces esperar un periodo de tiempo antes de que se pueda determinar si el embarazo se ha establecido o no. En algunos casos, el embarazo puede no establecerse nunca a pesar de múltiples intentos y estos casos representan un gasto considerable a la sociedad, en términos tanto financieros como humanos.

Por tanto, sería deseable proporcionar un ensayo que pueda indicar el potencial para la implantación de un oocito antes de la fecundación, haciendo posible que se maximicen las probabilidades de implantación satisfactoria del embrión, y permitiendo que se usen indicaciones de tasas bajas de éxito para evitar el trauma y los costes anteriormente mencionados de la fecundación asistida.

Leyendas de las figuras

Fig. 1. Curva ROC de un experimento Luminex para detectar G-CSF LF usando un kit Luminex de Biorad. La tasa de positivo auténtico (Sensibilidad) se representa en función de la tasa de falso positivo (100-Especificidad) para distintos puntos de corte de concentración de G-CSF-LF. Cada punto en la representación ROC representa un par sensibilidad/especificidad que corresponde a un umbral de decisión específico. El área bajo la curva ROC es una medida de lo bien que G-CSF-LF puede distinguir entre dos grupos de diagnóstico principales (implantación segura/sin implantación). Línea 1: El área bajo la curva es 0,82, lo que indica que un individuo seleccionado aleatoriamente del grupo positivo tiene un valor de ensayo mayor que el de un individuo seleccionado aleatoriamente del grupo negativo el 82% de las veces. Línea 2: el área bajo la curva ROC es 0,5, representando la hipótesis nula.

Fig. 2. Curva ROC de un experimento Luminex para detectar G-CSF LF usando un kit Luminex de R and D. Línea 3: El Área bajo la curva es 0,72, lo que indica que un individuo seleccionado aleatoriamente del grupo positivo tiene un valor de ensayo mayor que el de un individuo seleccionado aleatoriamente del grupo negativo un 72% de las veces. Línea 4: El Área bajo la curva ROC es 0,5 representando la hipótesis nula.

Fig. 3. Gráfica que muestra la variación en concentración de líquido folicular individual de una misma cohorte de embriones obtenidos de múltiples sujetos. Cada caja muestra la variación de líquidos foliculares individuales con respecto a la media en una misma cohorte de embriones generada.

Resumen de la invención

La invención se basa en un descubrimiento inesperado de los inventores de que un sujeto femenino que proporciona una pluralidad de oocitos bajo hiperestimulación ovárica exhibirá una variación en los niveles de varias citoquinas y factores de crecimiento presentes en el líquido folicular del folículo del que deriva cada oocito. Además, los inventores descubrieron que hay una fuerte correlación entre un alto nivel de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) presente en el líquido folicular del folículo individual del que deriva un oocito y un alto potencial de implantación de un embrión obtenido por fecundación de dicho oocito. Nunca se ha demostrado antes que, para el mismo sujeto, el líquido folicular que rodea cada oocito individual puede variar en composición y que dicha composición es indicativa del éxito de implantación del oocito fecundado posteriormente. Este descubrimiento permite clasificar una pluralidad de embriones obtenidos de una única paciente en orden de potencial de implantación. Por primera vez puede descubrirse que pacientes que muestran un potencial de fertilidad límite usando indicadores que hacen una media de marcadores de fertilidad de oocitos (por ejemplo 11-beta HSD) tienen oocitos que muestran un alto potencial de implantación frente a una media global pobre; esto ofrece nuevas posibilidades para mujeres que previamente tenían indicios de infertilidad. Además, el método ofrece la posibilidad de valorar cada oocito individualmente y por lo tanto el embrión individualmente, sin interferencia con el embrión u oocito.

La presente invención se refiere a un ensayo para determinar el potencial de implantación de una pluralidad de embriones, cada uno obtenido o que va a obtenerse por fecundación asistida de un oocito en un sujeto femenino, que comprende medir los niveles de G-CSF en el líquido folicular presente en el folículo del que deriva cada oocito y determinar el potencial de implantación de cada embrión a partir del nivel de G-CSF del líquido folicular. El oocito del folículo con el nivel mayor de G-CSF en el líquido folicular da lugar a un embrión con el mayor potencial de implantación.

Una realización de la invención es un ensayo para determinar para un sujeto femenino el potencial de implantación de embriones obtenidos o que van a obtenerse por fecundación asistida, que comprende:

Otra realización de la invención es un ensayo como se describe anteriormente, en el que los oocitos que tienen los niveles más altos de G-CSF LF tienen el mayor potencial de implantación.

Otra realización de la invención es un ensayo como se describe anteriormente, en el que cada muestra de LF se obtiene de un aspirado folicular.

Otra realización de la invención es un ensayo como se describe anteriormente, en el que los niveles respectivos de CSF-LF se miden en el plazo de 20 horas desde la recogida del aspirado folicular.

Otra realización de la invención es un ensayo como se describe anteriormente, en el que un nivel de CSF-LF igual o menor que 20,6 pg/ml determina un potencial de implantación nulo o bajo.

Otra realización de la invención es un ensayo como se describe anteriormente, en el que un nivel de CSF-LF igual o mayor que 24,0 pg/ml determina un potencial de implantación alto.

Otra realización de la invención es un ensayo como se describe anteriormente, en el que los niveles respectivos de G-CSF LF se miden usando un inmunoensayo.

Otra realización de la invención es un ensayo como se describe anteriormente, en el que los niveles respectivos de G-CSF LF se miden usando un ensayo competitivo o inmunométrico, tal como ensayo RIA, IRMA, ELISA o ELISPOT.

Otra realización de la invención es un ensayo como se describe anteriormente, en el que los niveles respectivos de G-CSF LF se miden usando un ensayo Luminex.