Un método para predecir un menor riesgo de preeclampsia, que comprende:

medir la cantidad de sFlt-1 libre en una muestra biológica obtenida de una mujer gestante, medir la cantidad de P1GF libre en la muestra biológica, y comparar la relación observada con un valor o intervalo de valores predeterminado

Campo técnico de la invención

El campo de la invención se refiere a la detección de factor de crecimiento placentario (PIGF), tirosina quinasa tipo fms soluble (sFlt-1) y moléculas relacionadas en muestras biológicas que se obtienen preferentemente de pacientes.

Antecedentes de la invención

El inmunodiagnóstico permite la detección, diagnóstico y pronóstico de enfermedades, disfunciones y otras afecciones que afligen o afectan a animales, incluyendo seres humanos. Se ha vuelto altamente deseable realizar ensayos de inmunodiagnóstico con la ayuda de un equipo de ensayo automático, que minimice el tiempo de manipulación de muestras y datos por parte del investigador. El rápido desarrollo comercial del inmunodiagnóstico desde 1980 ha sido posible en parte por tecnología que permite el aislamiento rápido y eficaz de anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo que se unen con una especificidad suficiente a marcadores que se encuentran en muestras biológicas, de modo que pueda reconocerse el marcador. Ha sido incluso más deseable para algunos ensayos de inmunodiagnóstico el uso de anticuerpos monoclonales, que en muchos casos permite al experto en la materia adaptar cuidadosamente el rendimiento, la especificidad y la sensibilidad de un ensayo a las necesidades particulares. Los anticuerpos también tienden a ser moléculas predecibles que son algo susceptibles de mejora por regeneración por ingeniería genética. Por lo tanto, se han convertido en elementos esenciales de los agentes de inmunodiagnóstico modernos.

Están disponibles otros reactivos para la detección de marcadores en muestras biológicas, pero la necesidad de caracterizar cuidadosamente estos agentes y de desarrollar técnicas únicas para su uso en inmunoensayos ha disuadido algo de su uso en el inmunodiagnóstico moderno. Esto es particularmente cierto cuando el reactivo distinto de anticuerpo es un polipéptido o proteína.

El VEGF y el P1GF pertenecen a una familia de péptidos reguladores que pueden controlar la formación de vasos sanguíneos y la permeabilidad vascular. Se cree que estas proteínas interaccionan con Flt-1 y KDF1/FLK1 para conseguir esta función (Mattei et al., Genomics, 32, 168-169, (1996)). Actualmente hay 3 supuestas isoformas de PIGF identificadas: PIGF1, PIGF2 y P1GF3. El P1GF2 puede unirse con heparina. Se cree que el PIGF2 es capaz de unirse a neuropilina-1 en células endoteliales de la vena umbilical humana de una forma dependiente de heparina. También se cree que la neuropilina-1 es capaz de unirse con P1GF1 con menor afinidad (Migdal et al., J Biol Chem, 273, 22272-22278(1998)).

Se cree que el P1GF es capaz de estimular la angiogénesis y el crecimiento colateral en el corazón y miembro isquémico con buena eficacia (Luttun et al., Nature Med 8, 831-840 (2002)). La activación de Flt-1 por P1GF puede causar angiogénesis. Tanto VEGF como PIGF se unen a Flt-1, sin embargo, se cree que la unión de P1GF con Flt-1 causa efectos biológicos diferentes que la unión de VEGF a Flt-1.

En mujeres gestantes que padecen preeclampsia, un aumento de la Flt-1 soluble (sFlt-1) puede causar una disminución de los niveles circulantes de VEGF libre y, especialmente, de P1GF, dando como resultado una disfunción de células endoteliales que podría aliviarse mediante VEGF y P1GF exógenos (Maynard et al., J Clin Invest, 111, 649-658 (2003)). Los niveles séricos de P1GF eran significativamente menores en mujeres que posteriormente tuvieron preeclampsia, que en mujeres que posteriormente no desarrollaron preeclampsia, en un estudio descrito por Levine et al. (New Eng J Med, 350, 672-683 (2004)). El estudio sugería que la diferencia podría ser perceptible hacia las aproximadamente 13 a aproximadamente 16 semanas de gestación, y la mayor diferencia en los niveles de P1GF era evidente más próxima al inicio de la preeclampsia. Levine et al. también sugirieron que el aumento en el nivel de sFlt-1 total en la sangre también era más pronunciado en las mujeres preeclámpsicas. Levine et al. sugirieron por lo tanto que niveles aumentados de sFlt-1 total y niveles inferiores de P1GF podían predecir el posterior desarrollo de preeclampsia.

Se cree que la sFlt-1 es una forma de corte y empalme alternativo de flt-1 que da como resultado una variante soluble de la proteína Flt-1 y que puede unirse tanto al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) con gran afinidad (Kendall et al., Biophys Res Commun, 226, 324-328 (1996)) como al PIGF. Estudios de deleción de dominios de la sFlt-1 han demostrado que los dominios 2 y 3 de la (s)Flt-1 permiten la unión a VEGF con casi la misma afinidad que la sFlt-1, y que el dominio 2 solo se une solamente 60 veces menos fuertemente que la sFlt-1 de longitud completa.

El documento WO2005/077007 menciona una medición de PIGF libre y sFlt-1 en forma unida, total o libre y VEGF (pág. 25, párrafo 2), pero no se describen herramientas para medir la sFlt-1 libre. Se propone el cálculo de la relación de sFlt-1 respecto a VEGF y PIGF (véase también del último párrafo de la pág. 24 al párrafo 1 de la página 25).

Sumario de la invención

La invención en su forma más amplia se define en las reivindicaciones independientes 1 y 2. Se definen realizaciones preferidas en las reivindicaciones 3-29.

Las reivindicaciones 1 y 2 dicen lo siguiente:

1. Un método para predecir un menor riesgo de preeclampsia, que comprende: medir la cantidad de sFlt-1 libre en una muestra biológica obtenida de una mujer gestante, midiendo la cantidad de PIGF libre en la muestra biológica y comparando la relación observada con un valor o intervalo de valores predeterminado.

2. Un método para predecir un menor riesgo de preeclampsia, que comprende: medir las cantidades de sFlt-1 total y sFlt-1 unida en una muestra biológica obtenida de una mujer gestante, midiendo la cantidad de PIGF libre en la muestra biológica y comparando la relación observada con un valor o intervalo de valores predeterminado.

La descripción implica el uso de un compañero de unión proteico distinto de una porción de un anticuerpo, usado para detectar la cantidad o la concentración de un segundo compañero de unión distinto de una porción de un anticuerpo, en una muestra biológica. Sólo se usa preferentemente un anticuerpo o porción del mismo en el método de la invención. Los compañeros de unión de la invención incluyen factor de crecimiento placentario (P1GF) y tirosina quinasa tipo fms soluble (sFlt-1), que es una porción de Flt-1 generada por corte y empalme alternativo del producto génico de Flt-1 y que es capaz de unirse con PIGF.

La descripción también proporciona un método de determinación de la cantidad de sFlt-1 que no está unida a P1GF ("sFlt-1 libre") y un método de determinación de la cantidad de P1GF que no está unido a sFlt-1 ("PIGF libre").

Además, la descripción proporciona un método de determinación de la relación de sFlt-1 libre respecto a PIGF libre.

En otra realización, la relación de sFlt-1 libre respecto a PIGF libre se usa para diagnosticar, predecir, controlar o terapia de control de la preeclampsia.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la capacidad de sFlt-1 para interaccionar con P1GF. Aunque la unión de dos moléculas de sFlt-1 con un homodímero de PIGF se ha sugerido por observaciones de sistemas experimentales, los inventores reconocen que este estado puede no existir in vivo o puede existir a niveles insignificantes, pero se presenta en la Fig. 1 porque el método de la invención es útil para la detección de dichos complejos si existen. La Figura 2 representa un histograma de los niveles de PIGF observados mediante un inmunoensayo que emplea un anticuerpo monoclonal usado para capturar P1GF libre y un anticuerpo policlonal usado para detectar PIGF en un pequeño número de muestras humanas recogidas e investigadas en condiciones éticamente apropiadas. La Figura 2 demuestra que bajos niveles de PIGF están asociados con gestaciones preeclámpsicas (PE) y también que la capacidad de separar gestaciones no preeclámpsicas (normales) de gestaciones preeclámpsicas usando dos anticuerpos contra PLGF está en necesidad de mejora. La Figura 3 representa un histograma de los datos recogidos usando un anticuerpo monoclonal como primer sbp para sFlt-1 y un anticuerpo policlonal como segundo sbp para sFlt-1. Estos datos muestran que hay una superposición significativa en el intervalo de valores de sFlt-1 total para mujeres gestantes no preeclámpsicas (normales) con el intervalo de valores de sFlt-1 total para mujeres... [Seguir leyendo]

1. Un método para predecir un menor riesgo de preeclampsia, que comprende: medir la cantidad de sFlt-1 libre en una muestra biológica obtenida de una mujer gestante, medir la cantidad de P1GF libre en la muestra biológica, y comparar la relación observada con un valor o intervalo de valores predeterminado.

2. Un método para predecir un menor riesgo de preeclampsia, que comprende: medir las cantidades de sFlt-1 total y sFlt-1 unida en una muestra biológica obtenida de una mujer gestante, medir la cantidad de P1GF libre en la muestra biológica, y comparar la relación observada con un valor o intervalo de valores predeterminado.

3. Un método de diagnóstico de la preeclampsia que comprende:

(a) determinar la cantidad de sFlt-1 libre en una muestra,

(b) determinar la cantidad de P1GF libre en una muestra, y

(c) dividir el valor de la etapa (a) por el valor de la etapa (b),

en el que cuando el resultado de la etapa (c) supera un valor predeterminado, entonces es diagnóstico de preeclampsia.

4. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la cantidad de P1GF libre se determina mediante las etapas de:

(a) proporcionar un resto marcado, en el que el resto marcado es un fragmento de PIGF o fragmento de sFlt-1,

(b) poner en contacto el resto marcado con el espécimen biológico,

(c) cuando el resto marcado comprende P1GF, determinar el grado de unión entre el resto marcado y la sFlt-1, o (c') cuando el resto marcado comprende sFlt-1, determinar el grado de unión entre el resto marcado y el P1GF y

(d) determinar la concentración o cantidad de PIGF libre presente en la muestra.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el método es un ensayo de diagnóstico automático, en el que el ensayo automático se realiza en un sistema que administra muestras y reactivos a un recipiente de reacción, realiza incubaciones (opcionalmente lavados) sin intervención del usuario una vez que la muestra y los reactivos se insertan en el sistema.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el sistema puede realizar al menos ocho ensayos en un periodo de 48 horas, sin intervención del usuario después de insertar la muestra y los reactivos en el sistema.

7. El método de la reivindicación 5 ó 6, en el que el sistema calcula la concentración o cantidad de la proteína de la pareja de unión, y en el que el usuario no se considera parte del sistema.

8. El método de la reivindicación 3, en el que el método es un ensayo tipo sándwich.

9. El método de la reivindicación 3, en el que el método es un ensayo de inhibición competitiva.

10. El método de la reivindicación 1 ó 2 en el que la cantidad de P1GF libre en la muestra biológica, en el que el P1GF libre no tiene un compañero de unión específico unido al sitio de unión a Flt-I de PIGF, se determina mediante las etapas de:

(a) proporcionar una muestra que contiene o es sospechosa de contener PIGF libre,

(b) poner la muestra en contacto con un primer compañero de unión específico (sbp) de P1GF capaz de formar un complejo de sbp:PIGF,

(c) poner la muestra en contacto con un segundo sbp, en el que el segundo sbp está marcado específicamente, en el que el primer sbp o segundo sbp es Flt-I o sFlt-1 o un fragmento de unión a PIGF de sFlt-1, en el que el primer sbp, el segundo sbp y el P1GF libre son capaces de formar un complejo ternario,

(d) determinar la cantidad de complejo ternario formado como medida de la cantidad de PIGF libre en la muestra.

11. El método de la reivindicación 2, en el que la cantidad de sFlt-1 total se determina mediante las etapas de:

(a) marcar un compañero de unión con un marcador detectable para formar un resto marcado,

(b) poner en contacto el resto marcado con el espécimen biológico, y

(c) determinar el grado de unión entre el resto marcado y un componente del espécimen biológico como indicio de la cantidad de sFlt-1 presente en el espécimen.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el método se realiza en un formato de cartucho o como una tira de ensayo, o en el que los reactivos de ensayo se proporcionan como un instrumento desechable de dosis unitaria,

y en el que la dosis unitaria contiene todos los reactivos necesarios para la realización del ensayo del método.

13. El método de la reivindicación 11 ó 12, en el que el método es un ensayo de diagnóstico automático, en el que el ensayo se realiza en un sistema que administra muestras y reactivos a un recipiente de reacción, realiza incubaciones (y opcionalmente lavados) sin intervención del usuario una vez que la muestra y los reactivos se insertan en el sistema.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el sistema puede realizar al menos ocho ensayos en un periodo de 48 horas, sin intervención del usuario después de insertar la muestra y los reactivos en el sistema.

15. El método de la reivindicación 13 ó 14, en el que el sistema calcula la concentración o la cantidad de sFlt-1.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en el que el método es un ensayo tipo sándwich.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en el que el método es un ensayo de inhibición competitiva.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-17, en el que el método emplea menos de dos anticuerpos o porciones de anticuerpos.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-18, en el que el P1GF está unido a células.

20. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad de sFlt-1 libre en la muestra biológica se determina mediante las etapas de:

(a) proporcionar una muestra que contiene o es sospechosa de contener sFlt-1 libre,

(b) poner la muestra en contacto con un primer compañero de unión específico (sbp) de sFlt-1 capaz de formar un complejo de sbp:sFlt-1,

(c) poner la muestra en contacto con un segundo sbp, en el que el segundo sbp está marcado de forma detectable, en el que el primer sbp o segundo sbp es PIGF, VEGF o un fragmento de unión a sFlt-1 de PIGF o VEGF, en el que el primer sbp, el segundo sbp y la sFlt-1 son capaces de formar un complejo ternario,

(d) determinar la cantidad de complejo ternario formado como medida de la cantidad de sFlt-1 en la muestra.

21. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad de sFlt-1 libre en la muestra biológica se determina mediante las etapas de:

(a) proporcionar una muestra que contiene o es sospechosa de contener sFlt-1 libre,

(b) poner la muestra en contacto con un anticuerpo unido a fase sólida que se une específicamente a sFlt-1, por lo que toda la sFlt-1 en la muestra biológica se captura en el sólido,

(c) poner la muestra en contacto con una porción marcada de forma detectable de un miembro de la familia de PIGF/VEGF, y

(d) determinar la cantidad de complejo ternario formado como medida de la cantidad de sFlt-1 en la muestra.

22. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad de sFlt-1 libre en la muestra biológica se determina mediante las etapas de:

(a) proporcionar una muestra que contiene o es sospechosa de contener sFlt-1 libre,

(b) poner la muestra en contacto con una porción de P1GF o VEGF inmovilizado sobre una superficie sólida,

(c) poner la muestra en contacto con un anticuerpo marcado de forma detectable que se une específicamente a sFlt-1, en el que la sFlt-1, el anticuerpo marcado de forma detectable y P1GF o VEGF son capaces de formar un complejo ternario, y

(d) determinar la cantidad de complejo ternario formado como medida de la cantidad de sFlt-1 en la muestra.

23. El método de la reivindicación 22, en el que la porción de PIGF o VEGF es una porción de PIGF, y la porción de unión a sFlt-1 de P1GF carece de los primeros 21 aminoácidos del PIGF.

24. El método de la reivindicación 23, en el que la porción de P1GF comprende además todo el dominio 1 aparte de aproximadamente los primeros 20 restos aminoacídicos del dominio 1.

25. El método de la reivindicación 20, en el que el P1GF o el fragmento de unión a sFlt-1 de PIGF está marcado de forma detectable mediante un marcador distinto de una superficie sólida.

26. El método de la reivindicación 25, en el que el marcador es un derivado de acridinio.

27. El método de la reivindicación 20, en el que el primer sbp o segundo sbp es un anticuerpo contra sFlt-1.

28. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad de sFlt-1 libre en la muestra biológica se determina mediante las etapas de:

(a) proporcionar una muestra que contiene o es sospechosa de contener sFlt-1 libre que no tiene PIGF unido a la sFlt-1,

(b) poner la muestra en contacto con un primer sbp que comprende una porción de unión a sFlt-1 de PIGF o VEGF, y un segundo sbp que comprende una porción de sFlt-1 que es capaz de unirse al fragmento de unión a sFlt-1 de PIGF o VEGF, en el que al menos el primer sbp o el segundo sbp está marcado,

(c) determinar la concentración de sFlt-1 presente en la muestra por determinación de la disminución de la unión, o de la inhibición de la unión, entre el primer sbp y el segundo sbp causada por la muestra respecto al nivel de unión entre el primer sbp y el segundo sbp cuando se ponen en contacto con una muestra que carece de sFlt-1 libre.

29. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad de sFlt-1 libre en la muestra biológica se determina mediante las etapas de:

(a) proporcionar una muestra que contiene o es sospechosa de contener sFlt-1 libre,

(b) proporcionar un primer compañero de unión específico (sbp) de sFlt-1 capaz de formar un primer complejo de sbp:sFlt-1, en el que el primer sbp está unido a una micropartícula magnética,

(c) poner la muestra en contacto con la micropartícula unida al primer sbp,

(d) opcionalmente lavar la micropartícula magnética para separar las porciones no unidas de la muestra de la micropartícula,

(e) poner la muestra en contacto con un segundo sbp, en el que el segundo sbp es PIGF marcado de forma detectable, en el que el primer sbp, el segundo sbp y la sFlt-1 son capaces de formar un complejo ternario,

(f) eliminar por lavado el P1GF marcado no unido de la micropartícula magnética, y

(g) determinar la cantidad de complejo ternario formado por detección de la cantidad de PIGF marcado unido a la micropartícula magnética como un indicio de la cantidad de sFlt-1 libre en el espécimen biológico.