El procedimiento comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra con una solución acuosa de etanol en presencia de una composición que comprende un agente reductor de grupos disulfuro y un agente disociante,

en un tampón de pH comprendido entre 7 y 8. El procedimiento permite extraer cuantitativamente el gluten contenido en una muestra de un alimento, tanto procesado por calor como no procesado por calor, como paso previo a la cuantificación por ELISA del gluten. De aplicación en el análisis de alimentos, en particular, de los alimentos destinados a los enfermos celiacos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiera a, en general, el análisis de alimentos para enfermos celiacos, y, especialmente, se refiere a un procedimiento para la extracción de gluten de alimentos, compatible con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), a composiciones adecuadas para la puesta en práctica de dicho procedimiento, a kits que comprenden dichas composiciones y a un procedimiento para la cuantificación por ELISA del gluten presente en los alimentos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La Enfermedad Celiaca (EC) es una enfermedad caracterizada por una intolerancia a las prolaminas del gluten de trigo, cebada, centeno y avena, que provoca cambios en el intestino que conllevan mal absorción.

El gluten, comprende una mezcla compleja de proteínas y, mientras no se conozca el componente o componentes tóxicos del gluten causantes de la EC, la solución provisional consiste en la eliminación de todos los componentes del gluten en la dieta de estos pacientes. De hecho, el único tratamiento realmente eficaz de la enfermedad celiaca consiste en seguir una dieta estrictamente libre de gluten. Por este motivo, resulta esencial poder cuantificar de forma precisa la cantidad de gluten de los alimentos destinados a ser ingeridos por los enfermos celiacos.

Sin embargo, un procedimiento fiable para medir el contenido en gluten de los alimentos ha sido una de las asignaturas pendientes en los últimos años. Actualmente, el gluten se determina mediante procedimientos dependientes de epítopo, tipo ELISA, que usan anticuerpos monoclonales o policlonales. Una técnica de ELISA útil para cuantificar el gluten contenido en alimentos lo describen L. Sorell y col., en el artículo titulado “An innovative sandwich ELISA system based on an antibody cocktail for gluten analysis", publicado en FEBS letters, 439,46-50 (1988).

El protocolo rutinario de análisis de gluten en alimentos para pacientes celiacos, tanto procesados por calor como no procesados por calor, consiste en la extracción del gluten con una solución acuosa de etanol al 60% (60% etanol/agua) seguido de su cuantificación por ELISA.

Uno de los principales problemas relacionados con la analítica del gluten en alimentos radica en que una gran proporción de los alimentos para pacientes celiacos son procesados a elevadas temperaturas (150-220°C). Debido a este tratamiento térmico, la mayoría de las fracciones tóxicas de la glucosa (α-, β-y γ-gliadinas) se desnaturalizan y se hacen insolubles por lo que no pueden ser extraídas con 60% etanol/agua.

Como consecuencia de ello, la determinación del contenido en gluten de estos alimentos procesados por calor, independientemente del ELISA utilizado, no resulta fiable. RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se enfrenta con el problema de desarrollar un procedimiento para la extracción cuantitativa del gluten contenido en alimentos, compatible con las pruebas de ELISA actualmente existentes para la cuantificación de gluten en alimentos.

La solución proporcionada por la presente invención se basa en la observación de los inventores de que el empleo de una composición que comprende un agente reductor de grupos disulfuro y un agente de disociación en un tampón con pH comprendido entre 7 y 8, antes de extraer el gluten con una solución acuosa de etanol al 60%, solubiliza las fracciones tóxicas del gluten, lo que permite analizar cuantitativamente el gluten contenido en alimentos.

El rendimiento de extracción de gluten de alimentos alcanzado mediante el procedimiento desarrollado por la presente invención es muy superior al obtenido mediante el sistema convencional de extracción de gluten basado únicamente en el empleo de 60% etanol/agua, tal como se muestra en las Tablas 1 y 2 (véanse los Ejemplos 1 y 3). De forma similar, la recuperación de gluten tanto de alimentos procesados por calor como de alimentos no procesados por calor es prácticamente cuantitativa, tal como se pone de manifiesto en la Figura 1 (véase el Ejemplo 2).

En la presente memoria se divulga un procedimiento para la extracción de gluten de alimentos, compatible con ELISA, que comprende efectuar la extracción del gluten con una solución acuosa de etanol en presencia de una composición que contiene un agente reductor de grupos disulfuro y un agente de disociación en un tampón con un pH comprendido entre 7 y

8. De forma adicional se divulga una composición útil para la puesta en práctica de dicho procedimiento de extracción de gluten de alimentos.

Un objeto adicional es un procedimiento para la cuantificación por ELISA del gluten contenido en una muestra de un alimento que comprende la extracción previa del gluten contenido en dicha muestra mediante el procedimiento de extracción de gluten previamente mencionado.

Otro objeto adicional es un kit que comprende la presente composición útil para la puesta en práctica de dicho procedimiento de extracción de gluten de alimentos, o sus componentes por separado. Este kit se puede usar para extraer el gluten contenido en un alimento como etapa previa a la cuantificación por ELISA del gluten contenido en un alimento. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 es un diagrama de barras que representa el porcentaje de recuperación de

gluten tanto en panes procesados a distintas temperaturas como en la harina usada para fabricar dichos panes, extraído mediante el procedimiento de extracción de gluten proporcionado por la presente invención (INVENCIÓN) o mediante un procedimiento de referencia (60% ETANOL) (véase el Ejemplo 2).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La divulgación proporciona una composición, en adelante denominada composición A, que comprende un agente reductor de grupos disulfuro y un agente de disociación, en un tampón con un pH comprendido entre 7 y 8.

El agente reductor de grupos disulfuro puede ser cualquier compuesto capaz de reducir grupos disulfuro, por ejemplo, 2-mercaptoetanol (2-ME), ditiotreitol, etc., y sus mezclas. La concentración del agente reductor de grupos disulfuro en la composición A puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otros factores, del agente reductor de grupos disulfuro empleado.

El agente de disociación puede ser cualquier compuesto con la capacidad de abrir la conformación de las proteínas haciendo más accesible regiones específicas de la cadena polipeptídica a reactivos externos y anticuerpos, por ejemplo, hidrocloruro de guanidina, urea, etc., y sus mezclas. La concentración del agente de disociación en la composición A puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otros factores, del agente de disociación empleado. En una realización, el agente de disociación es hidrocloruro de guanidina y la concentración de este compuesto en la composición A está comprendida entre 1 y 6 M. Análogamente, en otra realización, el agente de disociación es urea y la concentración de este compuesto en la composición A está comprendida entre 1 y 5 M.

El tampón puede ser cualquier disolución reguladora del pH de una disolución que tampone a un valor de pH comprendido entre 7 y 8, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) con un pH comprendido entre 7 y 8, Tris con un pH comprendido entre 7 y 8, etc.

En una realización específica de la composición A, el agente reductor de grupos disulfuro es el 2-ME, el agente de disociación es hidrocloruro de guanidina, y el tampón es PBS con un pH comprendido entre 7 y 8.

La composición es útil como "cóctel" de extracción de gluten de alimentos, de productos tanto procesados por calor como no procesados por calor. Ha resultado sorprendente observar que el uso de la composición A para la extracción de gluten (que contiene un agente reductor de grupos disulfuro y un agente de disociación en un tampón con un pH determinado) no afecta adversamente a la cuantificación por ELISA del gluten contenido en un alimento.

La invención también proporciona un procedimiento para la extracción de gluten de una muestra de un alimento, en adelante procedimiento de la invención, que comprende extraer el gluten contenido en esta muestra con una solución acuosa de etanol en presencia de la composición A.

De forma más específica, el procedimiento de la invención, que comprende extraer el gluten con una solución acuosa de etanol y separar el sobrenadante que contiene...

1. Un procedimiento para la extracción de gluten de una muestra de alimento que comprende extraer el gluten contenido en esta muestra con una solución acuosa de etanol en presencia de una composición que comprende un agente reductor de disulfuro y un agente de disociación de proteínas, en un tampón de pH comprendido entre 7 y 8.

2. Procedimiento para la extracción de gluten de una muestra de alimento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho agente reductor de disulfuro se selecciona de entre 2mercaptoetanol ditriotreitol y mezclas de los mismos.

3. Procedimiento para la extracción de gluten de una muestra de alimento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho agente de disociación se selecciona entre hidrocloruro de guanidina, urea y mezclas de los mismos.

4. Procedimiento para la extracción de gluten de una muestra de alimento de acuerdo con una cualquiera de las la reivindicaciones 1-3, en el que dicho agente reductor es 2mercaptoetanol y el agente de disociación de proteínas es hidrocloruro de guanidina.

5. Procedimiento para la extracción de gluten de una muestra de alimento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho tampón es solución salina tamponada con fosfato (PBS) con un pH comprendido entre 7 y 8, o Tris con pH entre 7 y 8.

6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicha solución acuosa de etanol tiene un contenido en etanol comprendido entre 50% y 70%.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende:

- mezclar la muestra que se va a someter a ensayo con una composición que comprende un agente reductor de disulfuro y un agente de disociación de proteínas en un tampón con un pH comprendido entre 7 y 8;

- incubar la mezcla resultante a una temperatura comprendida entre 37°C y 50°C,

durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 60 minutos -enfriar hasta temperatura ambiente; -añadir una solución acuosa de etanol y -retirar el sobrenadante que contiene el gluten extraído.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha mezcla resultante se incuba a una temperatura de 50°C durante 40 minutos.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que dicha solución acuosa de etanol es una solución acuosa de etanol al 60%.

10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la mezcla que contiene la muestra que se va a someter a ensayo, la composición que comprende un agente reductor de disulfuro y un agente de disociación de proteínas en un tampón con un pH comprendido entre 7 y 8 y la solución acuosa de etanol se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.

11. Un procedimiento para la cuantificación del gluten presente en una muestra de un alimento que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra usando un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, y, a continuación, cuantificar por ELISA el gluten extraído.

12. Un kit para extraer y cuantificar el gluten contenido en una muestra de alimento que comprende (i) una composición que comprende un agente reductor de disulfuro y un agente de disociación de proteínas en un tampón con un pH comprendido entre 7 y 8, o los componentes de dicha composición parcialmente mezclados o separados (ii) una solución acuosa de etanol

o los componentes de dicha solución acuosa de etanol por separado y (iii) anticuerpos monoclonales o policlonales para cuantificar mediante ELISA el gluten contenido.

13. Un kit de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el agente reductor de grupos disulfuro es 2-mercaptoetanol y el agente de disociación de proteínas es hidrocloruro de guanidina.

14. Un kit para extraer y cuantificar el gluten contenido en una muestra de alimento que comprende (i) una composición que comprende 2-mercaptoetanol como agente reductor de disulfuro e hidrocloruro de guanidina como agente de disociación de proteínas en un tampón con un pH comprendido entre 7 y 8, o los componentes de dicha composición parcialmente mezclados o separados y (ii) anticuerpos monoclonales o policlonales para cuantificar mediante ELISA el gluten contenido.