DISPOSITIVO Y PROCEDIMIENTO PARA LA ELECTROFORESIS PREPARATIVA.

Procedimiento para la electroforesis de membrana de sustancias disueltas o dispersadas en solución que contiene electrolito con uso de una cámara de separación (7a),

que presenta varios compartimentos para diluido (16a, 16b, ...), compartimentos para concentrado (17a, 17b, ...), así como un compartimento para el cátodo (18) y un compartimento para el ánodo (21) con electrodos como ánodo (19) y cátodo (20), en donde los compartimentos para diluido (16a, 16b, ...) y compartimentos para concentrado (17a, 17b, ...) están separados entre sí respectivamente con una membrana de separación porosa (15) y en donde el compartimento para el cátodo (18) y compartimento para el ánodo (21) están separados de los compartimentos para diluido (16a, 16b, ...) y compartimentos para concentrado (17a, 17b, ...), así como pares de compartimentos para diluido (16a, 16b, ...) y compartimentos para concentrado (17a, 17b, ...) sucesivamente, por membranas de restricción (14) porosas y los electrodos (19, 20) son lavados con la solución de lavado de electrodos y el diluido se conduce de forma continua por el compartimento de diluido (16), o el concentrado se conduce de forma continua por el compartimento de concentrado (17), caracterizado porque al menos una sustancia disuelta o dispersada en el diluido es transferida mediante un campo eléctrico dispuesto entre el ánodo (19) y el cátodo (20) electroforéticamente desde el compartimento del diluido (16) hasta el compartimento del concentrado (17), ajustándose entre el compartimento del diluido (16) y el compartimento del concentrado (17) una diferencia de presión de modo que se somete esencialmente una corriente de líquido a la membrana de separación (15) y al menos llega a 3 kPa y regulándose esta diferencia de presión mediante superposición de presión en los recipientes (1, 2)

La invención se refiere a un procedimiento y un dispositivo para llevar a cabo la electroforesis de membrana mediante membranas de micro– o ultrafiltración. A este respecto se compensa el flujo electroosmótico, que se forma en los poros de le membrana, mediante superposición de la presión.

El uso de electroforesis como técnica de separación preparativa se investiga desde los años 50.

Con la electroforesis de flujo libre continua fluye una solución a una cámara de electroforesis y se separa entre dos electrodos en campo eléctrico. En la entrada desde el módulo de electroforesis se distribuye la corriente de líquido en una multiplicidad de fracciones que contienen las sustancias que se van a separar en distintas concentraciones. Si bien esta técnica conduce a buenas selectividades a escala de laboratorio sólo es posible un aumento de escala en estrechos límites. Como problema principal se encuentra el calentamiento de la solución en el campo eléctrico así como los fenómenos de dispersión resultantes como, por ejemplo, la convección térmica. Con equipos de electroforesis de flujo libre disponibles en el mercado se pueden obtener productividades de algunos gramos de producto por día.

En la electroforesis de membrana actúan membranas semipermeables como barreras de convección entre compartimentos contiguos, pudiendo migrar al menos un componente disuelto en el campo eléctrico de un compartimento a otro.

En las primeras publicaciones se usaron membranas macroporosas, por ejemplo, papel de filtro. Estos materiales presentan sin embargo una serie de desventajas: apenas presentan selectividad por las sustancias que se van a separar (documentos US–A–3989613, US–A– 4043895) y además presentan frecuentemente una pobre estabilidad mecánica y química. Además estas ya muestran con diferencias de presión de menos de 1 kPa flujos de transmembrana inducidos por presión nada despreciables. Por tanto diferencias de presión variables en el tiempo o en el lugar entre compartimentos individuales conducen a una remezcla y a una reducción de la capacidad de separación. Este flujo de permeado inducido por presión fue reducido por Gritzner mediante incorporación de tanques de equilibrado (documento US–A–4043895). Mediante niveles variables se regulan las presiones hidrostáticas en los dos canales de corriente independientemente al mismo valor.

Patentes posteriores proponen el uso de membranas de ultrafiltración, que presentan una selectividad para macromoléculas de distinto tamaño. La capacidad de separación se puede mejorar claramente en teoría mediante la combinación de criterios de selectividad de movilidad electroforética y retención con membrana. Otras publicaciones sin ejemplo de realización (documentos DE 3337669, DE 3626953 A1) dieron a conocer ensayos en

discontinuo a escala de mililitros (documentos US–A–6270672).

Sin embargo en la práctica se observa con uso de membranas de ultrafiltración una productividad muy baja. En los poros de membrana se forma una capa doble eléctrica, que conduce en campo eléctrico a la inducción de un flujo electroosmótico, que reduce drásticamente la capacidad de separación de proteínas cargadas negativamente (Galier y col.,

J. Membr. Sci. 194 [2001] 117–133).

Si una especie de proteína está cargada positivamente en condiciones de separación, entonces se puede llevar a cabo la separación con polaridad de electrodos invertida. En este caso el flujo electroosmótico se contrapone o se equilibra con el transporte de proteína por la membrana. En correspondencia se observa un aumento o una reducción del nivel de líquido en el recipiente de diluido. Mientras que en el primer caso tiene lugar una reducción de la productividad, el segundo caso tiene como consecuencia una reducción de la capacidad de separación, ya que las proteínas pueden transportarse por convección por la membrana con menor movilidad de lo que deberían en el diluido.

Mediante la compensación de la diferencia de presión hidrostática en el módulo, como se describe por ejemplo en el documento US–A–4–043895, tampoco se pueden compensar corrientes de líquido por las membranas de separación.

Una alternativa al uso de membranas de ultra– y microfiltración lo representa el uso de membranas de gel. Este material no poroso ofrece la ventaja de un flujo electroosmótico bajo. La selectividad de la membrana de gel para macromoléculas puede verse influenciado por el grado de reticulación transversal del polímero (véase el documento US–A–4243507).

Sin embargo las membranas de gel muestran también una serie de desventajas frente a las membranas porosas.

Estas poseen una gran resistencia en campo eléctrico. Esto conduce a un elevado consumo de energía y con ello a un fuerte desprendimiento de calor en el módulo.

Los geles como poliacrilamida poseen una mala estabilidad al pH y por tanto no se pueden purificar como las membranas de ultra– y microfiltración convencionales. De esto resultan costes muy elevados para el uso de módulos ya que la limpieza es esencial en el procesamiento de proteínas.

Por una parte el uso de membranas de ultra– y microfiltración para la electroforesis de membrana está limitado hasta ahora por el efecto electroosmótico. Por otra parte se pueden usar membranas de gel concretamente con las desventajas citadas a escala de laboratorio, sin embargo un aumento de escala conduce a costes de membrana y consumo de energía elevados.

La invención se basa en el objetivo de desarrollar un procedimiento de electroforesis de membrana mejorado con uso de membranas de ultra– y microfiltración, que no presenten las desventajas citadas en el presente documento.

En base al flujo electroosmótico que se forma en membranas porosas, no fue posible hasta ahora, por ejemplo, un uso a escala industrial (> 0,5 kg/h).

Se ha encontrado que el flujo electroosmótico en las membranas usadas y los cambios de volumen resultantes de este se pueden compensar con superposición de una presión hidrostática regulada.

Es objeto de la invención un procedimiento para la electroforesis de membrana de sustancias disueltas o dispersadas en solución que contiene electrolito según la reivindicación 1 con uso de una cámara de separación, que presenta compartimentos de diluido, compartimentos de concentrado, así como un compartimento de cátodo y un compartimento de ánodo con electrodos como ánodo y cátodo, en donde los compartimentos individuales están separados entre sí por membranas porosas, de forma particular membranas de ultra– o microfiltración y los electrodos de la solución de lavado de electrodos se lavan y se conduce el diluido de forma continua por el compartimento de diluido y el concentrado de forma continua por el compartimento de concentrado, caracterizado porque al menos una sustancia disuelta

o dispersada en el diluido se transfiere electroforéticamente mediante un campo eléctrico dispuesto entre ánodo y cátodo desde el compartimento de diluido al compartimento de concentrado, estableciéndose esencialmente entre el compartimento de diluido y el compartimento de concentrado una diferencia de presión de al menos 3 kPa, regulada de modo que el compartimento de concentrado y el compartimento de diluido separa una corriente de líquido con la membrana de separación.

El procedimiento se lleva a cabo en una cámara de separación que se compone respectivamente de varios compartimentos de diluido y compartimentos de concentrado, estando dispuestos los compartimentos de diluido y los compartimentos de concentrado entre el compartimento del ánodo y el compartimento del cátodo alternativamente, separándose mediante membranas de ultra– y/o microfiltración y operando en paralelo y/o en serie.

De forma ventajosa en una realización preferida el líquido de diluido, líquido de concentrado y solución de lavado de electrodos o alguna de estas soluciones se encuentran a temperatura controlada independientemente una de otra, preferiblemente refrigeradas.

Las membranas porosas presentan de forma particular un tamaño de poro de 1 a 1000 nm.

Preferiblemente las membranas se basan en uno o varios de los siguientes materiales:

Éster de celulosa, poliacrilonitrilo, poliamida, poliéter, polietersulfona, polipropileno,

polisulfona,...

1. Procedimiento para la electroforesis de membrana de sustancias disueltas o dispersadas en solución que contiene electrolito con uso de una cámara de separación (7a), que presenta varios compartimentos para diluido (16a, 16b, …), compartimentos para concentrado (17a, 17b, …), así como un compartimento para el cátodo (18) y un compartimento para el ánodo (21) con electrodos como ánodo (19) y cátodo (20), en donde los compartimentos para diluido (16a, 16b, …) y compartimentos para concentrado (17a, 17b, …) están separados entre sí respectivamente con una membrana de separación porosa (15) y en donde el compartimento para el cátodo (18) y compartimento para el ánodo (21) están separados de los compartimentos para diluido (16a, 16b, …) y compartimentos para concentrado (17a, 17b, …), así como pares de compartimentos para diluido (16a, 16b, …) y compartimentos para concentrado (17a, 17b, …) sucesivamente, por membranas de restricción

(14) porosas y los electrodos (19, 20) son lavados con la solución de lavado de electrodos y el diluido se conduce de forma continua por el compartimento de diluido (16), o el concentrado se conduce de forma continua por el compartimento de concentrado (17), caracterizado porque al menos una sustancia disuelta o dispersada en el diluido es transferida mediante un campo eléctrico dispuesto entre el ánodo (19) y el cátodo (20) electroforéticamente desde el compartimento del diluido (16) hasta el compartimento del concentrado (17), ajustándose entre el compartimento del diluido (16) y el compartimento del concentrado (17) una diferencia de presión de modo que se somete esencialmente una corriente de líquido a la membrana de separación (15) y al menos llega a 3 kPa y regulándose esta diferencia de presión mediante superposición de presión en los recipientes (1, 2).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los diversos compartimentos de diluido (16a, 16b, …) y compartimentos de concentrado (17a, 17b, …) son operados en paralelo y/o en serie.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el líquido del diluido, líquido del concentrado y solución de lavado del electrodo o alguna o algunas de estas soluciones se encuentran a temperatura controlada, preferiblemente refrigeradas independientemente una de otra.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las membranas presentan un tamaño de poro de 1 a 1000 nm.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque las membranas se basan en uno de los siguientes materiales: éster de celulosa, poliacrilonitrilo, poliamida, poliéter, polietersulfona, polipropileno, polisulfona, alcohol polivinílico, fluoruro de polivinilideno, u óxido de aluminio, óxido de silicio, óxido de titanio, óxido de circonio así como materiales cerámicos mixtos de los óxidos citados anteriormente.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la solución de lavado de electrodos fluye a través del compartimento del ánodo (21) y del compartimento del cátodo (18) independientemente uno de otro.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el electrolito usado para la solución de diluido, la solución de concentrado y la solución de lavado de electrodos contiene una combinación de ácidos débiles y bases débiles, ácidos fuertes y bases fuertes o ácidos fuertes y bases débiles.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque los electrolitos contienen uno o varios de los siguientes compuestos: ácido bórico, ácido fosfórico, ácido N–2– (acetamido)–2–aminoetanosulfónico, ácido N–2–(acetamido)iminodiacético, alanina, 2–amino–2– metil–1,3–propanodiol, amoniaco, ácido N,N–bis(2–hidroxietil)–2–aminoetanosulfónico, N,N–bis– (2–hidroxietil)glicina, 2,2–bis(hidroxietil)–iminatris(hidroximetil)metano, ácido 2– (ciclohexilamino)etanosulfónico, ácido acético, glicina, glicilglicina, ácido 2–[4–(2–hidroxietil)–1– piperazinil]etanosulfónico, ácido 3–[4–(2–hidroxietil)–1–piperazinil]propanosulfónico, histidina, imidazol, ácido láctico, ácido 2–morfolinoetanosulfónico, ácido 2–morfolinopropanosulfónico, ácido piperazin–1,4–bis(2–etanosulfónico), ácido N–[tris(hidroximetil)–metil]–2– aminoetanosulfónico, N–[tris(hidroximetil)–metil]glicina, trietanolamina, tris(hidroximetil)aminometano, ácido cítrico.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la densidad de corriente referida a la superficie de membrana es de 10 a 1000 A/m2, preferiblemente de 10 a 500 A/m2.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la conductividad eléctrica de la solución de diluido es de 0,1 mS/cm a 40 mS/cm, preferiblemente de 0,1 a 10 mS/cm.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la solución de diluido se concentra a continuación del secado, de forma particular mediante combinación con una permeación del líquido como, por ejemplo, microfiltración, ultrafiltración, nanofiltración u ósmosis inversa y se añade de nuevo al compartimento del diluido (16).

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes en el que se tratan una o varias de las siguientes sustancias: proteínas, péptidos, ADN, ARN, oligonucleótidos, oligo– y polisacáridos, virus, componentes de virus, células, componentes de células, enantiómeros y diastereómeros.

13. Dispositivo para la electroforesis de membrana que comprende al menos una cámara de separación (7a), que presenta varios compartimentos de diluido (16a, 16b, …) y compartimentos de concentrado (17a, 17b, …) así como un compartimento de cátodo (18) y un compartimento de ánodo (21) con electrodos como ánodo (19) o cátodo (20), en donde los compartimentos de diluido (16a, 16b, …) y compartimentos de concentrado (17a, 17b, …) están separados respectivamente por una membrana de separación (15) y en donde el compartimento del cátodo (18) y el compartimento del ánodo (21), están separados de los compartimentos de diluido (16a, 16b, …) y compartimentos de concentrado (17a, 17b, …), así como pares de compartimentos de diluido (16a, 16b, …) y compartimentos de concentrado (17a, 17b, …) entre sí, mediante membranas de restricción porosas (14), las conducciones de alimentación (22) y de retorno (23) para el diluido, las conducciones de alimentación (24) y de retorno (25) para el concentrado, dado el caso conducciones de alimentación (26) y de retorno

(27) para la solución de lavado de electrodos así como un dispositivo (8; 10) o (9;11) para la regulación de presión, mediante el que se produce una diferencia de presión entre los compartimentos de diluido (16a, 16b, …) y compartimentos para concentrado (17a, 17b, …) de al menos 3 kPa y se puede regular de este modo que una corriente de líquido se pueda someter esencialmente mediante la membrana de separación (15) en donde como dispositivo para el ajuste de la presión están previstos recipientes (1, 2) resistentes a la presión con medios para la regulación de presión (12, 13).

14. Dispositivo según la reivindicación 13, caracterizado porque los diversos compartimentos de diluido (16a, 16b, …) y compartimentos de concentrado (17a, 17b, …) se conectan en paralelo y/o en serie.

15. Dispositivo según una de las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque los

conductos de alimentación (22) y de retorno (23) para el diluido están dispuestos en un circuito de diluido (1; 4; 22; 23), los conductos de alimentación (24) y de retorno (25) para el concentrado están dispuestos en un circuito de concentrado (2; 5; 24; 25), dado el caso los conductos de alimentación (26) y de retorno (27) para la solución de lavado de electrodos

5 están dispuestos en un circuito de lavado de electrodos (3; 6; 26; 27).

16. Dispositivo según una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque presentan un circuito de diluido, circuito de concentrado y circuito de lavado de electrodos y presenta intercambiador de calor en algunos o todos estos circuitos.

17. Dispositivo según una de las reivindicaciones 13 a16, caracterizado porque están presentes membranas porosas con un tamaño de poro de 1 a 1000 mm. Estas se preparan preferiblemente a partir de materiales orgánicos o inorgánicos o de una mezcla de ambos.

18. Dispositivo según una de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque las membranas se basan en uno de los materiales seleccionados del grupo de: éster de celulosa, poliacrilonitrilo, poliamida, poliéter, polietersulfona, polipropileno, polisulfona, alcohol polivinílico, fluoruro de polivinilideno o de óxido de aluminio, óxido de silicio, óxido de titanio, óxido de circonio así como materiales cerámicos mixtos de los óxidos citados anteriormente.

19. Dispositivo según una de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque el circuito de lavado de electrodos se forma mediante un circuito de lavado de ánodos y circuito de lavado de cátodos separados.