SE HA UTILIZADO UN VECTOR DE EXPRESION DE LA BIBLIOTECA ADNC DERIVADO DE CELULAS SENESCENTES PARA AISLAR CLONES DE ADNC QUE CODIFICAN LOS INHIBIDORES DE LA SINTESIS DE ADN.

DICHOS INHIBIDORES TIENEN UNA FUNCION EN LA SENESCENCIA CELULAR, EL ENVEJECIMIENTO Y LA NEOPLASIA. LOS ACIDOS NUCLEICOS DE CONTRASENTIDO REDUCEN LA INHIBICION DE LA SINTESIS DEL ADN. LA INVENCION SE REFIERE A DICHAS MOLECULAS, SUS INHIBIDORES, ANTAGONISTAS Y DERIVADOS. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN AL DIAGNOSTICO TERAPEUTICO E IN VITRO PARA LA UTILIZACION DE TODOS LOS CITADOS AGENTES

CAMPO DE LA INVENCIÓN:

La presente invención radica en el campo de la tecnología del ADN recombinante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:

Las células diploides humanas normales tienen un potencial finito para el crecimiento proliferativo 10 (Hayflick, L. et al., Exp. Cell Res. 25:585 (1961); Hayflick, L., Exp. Cell Res. 37:614 (1965)). En efecto, en condiciones controladas las células humanas cultivadas in vitro pueden proliferar máximamente solamente hasta aproximadamente 80 duplicaciones de población cumulativa. 15 Se ha encontrado que el potencial proliferativo de tales células es una función del número de duplicaciones de población cumulativa que la célula ha experimentado (Hayflick, L. et al., Exp. Cell Res. 25: 585 (1961); Hayflick, L. et al., Exp. Cell Res. 37: 614 (1985)). Este 20 potencial también es inversamente proporcional a la edad in vivo del donante celular (Martin, G.M. et al., Lab. Invest. 23:86 (1979); Goldstein, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 64:155 (1969); Schneider, E.L., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 73:3584 (1976); LeGuilty, Y. et al., Gereontologia 19:303 (1973)).

Se dice que las células que han agotado su potencial para el crecimiento proliferativo han experimentado "senescencia". La senescencia celular in vitro se demuestra por medio de cambios morfológicos y está acompañada del fracaso de una célula para responder a factores de crecimiento exógenos. La senescencia celular, de este modo, representa una pérdida del potencial proliferativo de la célula. Aunque se ha propuesto una variedad de teorías para explicar el fenómeno de la

senescencia celular in vitro, la evidencia experimental sugiere que la pérdida dependiente de la edad del potencial proliferativo puede ser función de un programa genético (Orgel, L.E., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)

49:517 (1963); De Mars, R. et al., Human Genet. 16:87 (1972); M. Buchwald, Mutat. Res. 44:401 (1977); Martin,

G.M. et al., Amer. J. Pathol. 74:137 (1974); Smith, J.R. et al., Mech. Age. Dev. 13:387 (1980); Kirkwood, T.B.L. et al., Theor. Biol. 53:481 (1975).

Los estudios de fusión celular con fibroblastos humanos in vitro han demostrado que el fenotipo quiescente de la senescencia celular es dominante sobre el fenotipo proliferativo (Pereira-Smith, O.M et al., Somat. Cell Genet. 8:731 (1982); Norwood, T.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 71:223 (1974); Stein,

G.H. et al., Exp. Cell Res. 130:155 (1979)).

Se ha llegado a comprender el fenómeno de la senescencia a partir de estudios en los cuales se han fusionado células senescentes y jóvenes (esto es, no senescentes) para formar heterodicariones. Con el fin de inducir senescencia en el núcleo "joven" del heterodicarión (determinada por una inhibición de la síntesis de ADN), debe tener lugar la síntesis de proteínas en la célula senescente antes de la fusión (Burmer, G.C. y col., J. Cell Biol. 94:187 (1982); Drescher-Lincoln, C.K. y col., Exp. Cell Res. 144:455 (1983); Burmer, G.C. y col., Exp. Cell Res. 145:708 (1983); Drescher-Lincoln, C.K. y col., Exp. Cell Res.

153:208 (1984)).

Igualmente, se ha encontrado que la microinyección de ARNm de fibroblastos senescentes en fibroblastos jóvenes inhibe la capacidad de las células jóvenes para sintetizar ADN (Lumpkin, C.K. y col., Science 232:393 (1986)). Los investigadores han identificado ARNm exclusivos que son amplificados en células senescentes in vitro (West, M.D. y col., Exp. Cell Res. 184:138 (1989); Giordano, T. y col., Exp. Cell Res. 185:399 (1989)).

La célula endotelial diploide humana representa un tipo celular alternativo para el estudio de la senescencia celular, debido a que tales células remedan la senescencia celular in vitro (Maciag, T. y col., J. Cell Biol. 91:420 (1981); Gordon, P.B. y col., In Vitro

19:661 (1983); Johnson, A. y col., Mech. Age. Dev. 18:1 (1982); Thornton, S.C. y col., Science 222:623 (1983); Van Hinsbergh, V.W.M. y col., Eur. J. Cell Biol. 42:101 (1986); Nichols, W.W. y col., J. Cell Physiol. 132:453 (1987)).

Además, la célula endotelial humana es capaz de expresar una variedad de fenotipos funcionales y reversibles. La célula endotelial muestra varios fenotipos de diferenciación quiescentes y no terminales (Folkman, J. et al., Nature 288:551 (1980); Maciag, T. et al., J. Cell Biol. 94:511 (1982); Madri. J.A. et al., J. Cell Biol. 97:153 (1983); Montesano, R., J. Cell Biol. 99:1706 (1984); Montesano, R. et al., J. Cell Physiol.

34:460 (1988)).

Se ha sugerido que la ruta de diferenciación de células humanas in vitro implica la inducción de quiescencia celular mediada por citoquinas que inhiben la proliferación de las células endoteliales inducida por factores de crecimiento in vitro (Jay, M. y col., Science

288:882 (1985); Madri, J.A. y col., In Vitro 23:387 (1987); Kubota, Y. y col., J. Cell Biol. 107:1589 (1988); Ingber, D.E. y col., J. Cell Biol. 107:317 (1989)). Los inhibidores de la proliferación de células endoteliales funcionan también como reguladores de los acontecimientos transcripcionales tempranos inmediatos inducidos durante la diferenciación de las células endoteliales in vitro, que implica la formación del fenotipo tubular, semejante a un capilar, de las células endoteliales (Maciag, T., En: Imp. Adv. Oncol. (De Vita, V.T. y col., eds., J.B. Lippincott, Philadelphia, 42 (1990); Goldgaber, D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7606 (1990); Hla, T. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 167:637 (1990)). Los inhibidores de la proliferación celular incluyen:

1. 1. Interleuquina-1a (IL-1a) (Montesano, R. y col.,

J. Cell Biol. 99:1706 (1984); Montesano, R. y col.,

J. Cell Physiol. 122:424 (1985); Maciag, T. y col., Science 249:1570-1574 (1990));

2. Factor de necrosis tumoral (Frater-Schroder, M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:5277 (1987); Sato, N. y col., J. Natl. Cancer Inst. 76:1113 (1986); Pber, J.P., Amer. J. Pathol. 133:426 (1988); Shimada, Y. y col., J. Cell Physiol. 142:31 (1990);

3. Factor de crecimiento transformante-β (Baird, A. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 138:476 (1986); Mullew, G. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:5600 (1987); Mairi, J.A. y col., J. Cell Biol. 106:1375 (1988));

4. Interferon-gamma (Friesel, R. y col., J. Cell Biol.

104:689 (1987); Tsuruoka, N. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 155:429 (1988)) y

5. El promotor tumoral acido forbolmirístico (PMA) (Montesano, R. y col., Cell 42:469 (1985); Doctrow,

S.R. y col., J. Cell Biol. 104:679 (1987); Montesano, R. y col., J. Cell Physiol. 130:284

(1987); Hoshi, H. y col., FASAB J. 2:2797 (1988)).

La posibilidad de revertir la senescencia y restaurar el potencial proliferativo de las células tiene implicaciones en muchos campos de empeño. Muchas de las enfermedades de la tercera edad están asociadas con la perdida de este potencial. La restauración de esta capacidad tendrá implicaciones transcendentales para el tratamiento de esta enfermedad, de otros trastornos relacionados con la edad y del envejecimiento per se.

Además, la restauración del potencial proliferativo de las células cultivadas tiene utilizaciones en medicina y en la industria farmacéutica. La capacidad para inmortalizar células no transformadas puede ser utilizada para generar un suministro inacabable de ciertos tejidos y también de productos celulares.

La significación de la senescencia celular ha sido apreciada por consiguiente durante varios años (Smith, J.R., Cellular Ageing, En: Monographs in Developmental Biology; Sauer, H.W. (Ed.), S. Karger, New York, N.Y. 17:193-208 (1984); Smith, J.R. y col., Exper. Gerontol. 24:377-381 (1989)). Los investigadores han intentado clonar genes relevantes para la senescencia celular. Se ha reconocido una correlación entre la existencia de un inhibidor de la síntesis de ADN y el fenómeno de la senescencia celular (Spiering, A.I. y col., Exp. Cell Res. 179:159-167 (1988); Pereira-Smith, O.M. y col., Exp. Cell Res. 160:297-306 (1985); Drescher-Lincoln, C.K. y col., Exp. Cell Res. 153:208-217 (1984); Drescher-Lincoln, C.K. y col., Exp. Cell Res. 144:455-462 (1983)). Además, se ha identificado la abundancia relativa de ciertas moléculas de ARN asociadas con la senescencia (Lumpkin, C.K. y col., Science 232:393-395 (1986)).

Varios laboratorios han utilizado el método de selección por "sustracción diferencial" para identificar moléculas de ADNc...

1. Un fragmento de un polipéptido SDI-1 del SEQ ID NO:2 donde los residuos de aminoácidos 72 a 164 se suprimen, donde el fragmento inhibe la síntesis de ADN.

2. Un fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene los residuos del SEQ ID NO:2 seleccionados del grupo que consiste en 5 a 70, 10 a 70, 15 a 70, 20 a 70, 25 a 70, 30 a 70, 35 a 70 y 40 a 70.

3. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

4. Un plásmido o vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4, que es un vector viral.

6. Un fragmento antisentido de SDI-1 que consiste en:

(a) la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:3;

(b) los nucleótidos 1 a 127 de la cadena antisentido del SEQ ID NO: 1; o

(c) los nucleótidos 1 a 319 de la cadena antisentido del SEQ ID NO: 1.

7. Un plásmido o vector de expresión que comprende un fragmento antisentido de acuerdo con la reivindicación

6.

8. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7, que es un vector viral.

9. Una composición farmacéutica que comprende un fragmento polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3, un fragmento antisentido de acuerdo con la reivindicación 6, o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4, 5, 7 u 8 y un vehículo, excipiente o estabilizador fisiológicamente aceptables.

10. El uso de un fragmento polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3 o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 para la fabricación de un medicamento para su uso en la inhibición de la síntesis de ADN en una célula receptora.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde la célula receptora es una célula tumoral que es una célula mieloide, una célula de linfoma de células B, una célula epitelial, una célula de glioblastoma, un fibroblasto o una célula de tumor de ovario.

12. El uso de un fragmento polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3 o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del glaucoma.

13. El uso de un fragmento antisentido de acuerdo con la reivindicación 6, o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para la fabricación de un medicamento para su uso en la des-represión de la síntesis de ADN en una célula receptora.

14. Un fragmento polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3, o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, para su uso en un método para inhibir la síntesis de ADN en una célula receptora.

15. Un fragmento polipeptídico, la secuencia de nucleótidos, plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, para su uso en dicho método en el que la célula receptora es una célula tumoral, que es una célula mieloide, una célula de linfoma de células B, una célula epitelial, una célula de glioblastoma, un fibroblasto o un célula de tumor de ovario.

16. Un fragmento polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3, o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, para su uso en un método para tratar el glaucoma.

17. Un fragmento antisentido de acuerdo con la reivindicación 6, o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, para su uso en un método para des-reprimir la síntesis de ADN en una célula receptora.