GEN DE ARTRITIS REUMATOIDE Y MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR ARTRITIS REUMATOIDE.

Gen de artritis reumatoide y método para diagnosticar artritis reumatoide Campo técnico La presente invención se refiere al gen de enfermedad de la artritis reumatoide presente en cromosoma humano X y a un método in vitro para diagnosticar artritis reumatoide que detecta la presencia del gen de enfermedad o su producto de expresión. Antecedentes técnicos Aunque se han aclarado aspectos, en particular el proceso patológico, de la artritis y artritis mutilante que causan artritis reumatoide, a través de varias investigaciones, debido a que la mayoría de las enfermedades autoinmunes asociadas con artritis reumatoide se desarrollan o empeoran en la enfermedad solo cuando coinciden varios factores causantes, la interacción misma de múltiples factores se debe aclarar para entender la enfermedad y para desarrollar métodos apropiados de tratamiento. El número de pacientes con artritis reumatoide en el mundo es del 1% o menos (N. Engl. J. Med. 322: 1277-1289, 1990), pero entre hermanos de pacientes, más del 8% desarrollan la enfermedad (Cell. 85: 311-318, 1996), lo que lleva a la noción de que debe estar implicado algún factor genético. Sin embargo, los procedimientos de genética molecular y procesos de ingeniería genética usados convencionalmente para descubrir el factor genético de enfermedades pueden no ser eficaces para enfermedades autoinmunes. Tal problema se produce por el hecho de que las enfermedades autoinmunes no se desarrollan a través de mecanismos tan sencillos como los del cáncer, en donde se produce el crecimiento anormal de un gen mutado. Además, aunque los procedimientos genéticos clásicos que buscan la base genética de una enfermedad revelaron que las enfermedades autoinmunes están producidas por múltiples factores genéticos, no ha tenido éxito en el descubrimiento de sus entrañas o su cuerpo. Por tanto, no se ha sabido casi nada sobre la entidad, o incluso el locus, de los genes asociados con artritis reumatoide. Mediante la realización de análisis de ligamiento usando marcadores de microsatélite en pacientes de artritis reumatoide y sus familiares, los presentes inventores identificaron tres locus de genes de artritis reumatoide (International Immunology 10(12): 1891-1895, 1998; Journal of Clinical Rheumatology 4 (3): 156-158, 1998) y presentaron una solicitud de patente para los siguientes genes de enfermedad (PCT/JP98/01665). (1) Un gen de enfermedad de artritis reumatoide localizado en la región a ± 1 centimorgan de una secuencia de ADN en el cromosoma humano 1 con el que hibrida(n) el/los marcador(es) de microsatélite D1S214 y/o D1S253. (2) Un gen de enfermedad de artritis reumatoide localizado en la región a ± 1 centimorgan de una secuencia de ADN en el cromosoma humano 8 con el que hibrida el marcador de microsatélite D8S556. (3) Un gen de enfermedad de artritis reumatoide localizado en la región a ± 1 centimorgan de una secuencia de ADN en el cromosoma humano X con el que hibrida(n) el/los marcador(es) de microsatélite DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 y/o DXS1232. Los presentes inventores identificaron, como resultado de estudios adicionales en cada uno de los genes de artritis reumatoide especificados en la solicitud previa descrita anteriormente, el gen específico respecto al gen de enfermedad (3) descrito anteriormente y determinaron su estructura molecular. Divulgación de la invención ES 2 367 767 T3 Para resolver los problemas descritos anteriormente, la presente invención proporciona un fragmento de ADN como se reivindica en la reivindicación 1 de un gen de enfermedad para artritis reumatoide que es un mutante del protooncogén Db1, en donde la secuencia normal de nucleótidos 2679 a 2952 del protooncogén Db1 se muestra en SEQ ID NO: 1, y en donde en dicho mutante la región desde el nucleótido 19 al 274 en SEQ ID NO: 1 se sustituye con los nucleótidos de la secuencia de SEQ ID NO: 2. La presente invención también proporciona un ADN que consiste en una parte del ADN de la reivindicación 1 en donde dicha parte comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 3 o un complemento de la misma y que se puede usar como una sonda para el diagnóstico genético; una proteína que consiste en SEQ ID NO: 2; un péptido que consiste en una parte de la proteína de SEQ ID NO: 2 donde dicho péptido comprende 5 residuos de aminoácidos o más de dicha secuencia y que se puede usar como un antígeno para preparar un anticuerpo; y un anticuerpo contra tal péptido. Además, la presente invención proporciona un método in vitro para el diagnóstico de artritis reumatoide que comprende la detección del ARNm complementario al ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o la proteína de la reivindicación 3 o el péptido de la reivindicación 4 en una muestra biológica. 2 Mejores maneras para llevar a cabo la invención ES 2 367 767 T3 De aquí en adelante, se describirán formas de realización de la presente invención que tienen las características descritas anteriormente. El gen de enfermedad de la artritis reumatoide divulgado aquí (de aquí en adelante denominado gen de enfermedad AR) es una secuencia variante del protooncogén conocido gen Db1 (EMBO J. 7(8): 2463-5473, 1998; No. de acceso de GenBank X12556) que se aísla del cromosoma humano X por el método descrito en los ejemplos mencionados posteriormente. En otras palabras, este gen Db1 transcribe el ARNm que codifica el ADNc para el que la secuencia de las bases 2679 a 2952 se representa en SEQ ID NO: 1, mientras que en el ADNc del gen variante, la secuencia del lado 3 de la base 241 en SEQ ID NO: 1 está unida al lado posterior a la base 18 para inducir un cambio en el marco de lectura en la traducción de aminoácidos, lo que produce que las bases 19 a 274 en SEQ ID NO: 1 se sustituyan por la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2. La figura 1 muestra la secuencia de bases de las bases 2679 a 2952 (las misma que en SEQ ID NO: 1) del ADNc del gen Db1 en un gen normal, la secuencia de bases correspondiente del gen de enfermedad AR, y las secuencias de aminoácidos respectivas (notación de una letra) codificadas por estas secuencias. Además, en general, con frecuencia se encuentra polimorfismo de diferencias individuales para genes humanos. Los ADNc divulgados en el presente documento se pueden aislar fácilmente, por ejemplo, mediante el método descrito en el ejemplo posteriormente mencionado. Además, los ADNc se pueden clonar de una genoteca de ADNc por un método conocido (Mol. Cell. Biol. 2:161-170, 1982; J. Gene 25: 263-269, 1983; Gene 150: 243-250, 1994) usando ARN poli(A)+ extraído de células de un paciente con artritis reumatoide. Tal clonación se puede realizar mediante, por ejemplo, síntesis de oligonucleótidos basados en la información de secuencia proporcionada en el presente documento y cribado mediante hibridación en colonia o placa por un método conocido usando los oligonucleótidos resultante como sondas. Además, se pueden sintetizar oligonucleótidos que hibriden con ambos extremos del fragmento de ADNc diana, y usándolos como cebadores, se puede producir el ADNc por el método de RT-PCR a partir de los ARNm aislados de células de un paciente con artritis reumatoide. El fragmento de ADN de la presente invención comprende una parte del ADNc anteriormente mencionado y contiene la secuencia de bases mostrada en SEQ ID NO: 3. En otras palabras, SEQ ID NO: 3 es la secuencia subrayada en la figura 1 y es una región característica, que no está presente en el gen Db1 normal o sus ADNc. Además, el fragmento de ADN incluye las hebras tanto sentido como antisentido. Estos fragmentos de ADN se pueden usar como sondas para el diagnóstico genético. La proteína de la presente invención es una parte de un producto de expresión resultante de los genes de enfermedad AR divulgados en el presente documento y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2. Esta proteína se puede obtener por un método de síntesis química de péptidos basado en la secuencia de aminoácidos proporcionada por la presente solicitud, o mediante técnicas de ADN recombinante usando los ADNc divulgados en el presente documento. Por ejemplo, cuando se usa la técnica del ADN recombinante para obtener las proteínas, se puede preparar el ARN mediante transcripción in vitro usando un vector que contiene el ADNc divulgado en el presente documento; usando este ARN como molde, las proteínas se pueden obtener mediante traducción in vitro. Además, la región codificante del ADNc se puede recombinar en un vector de expresión apropiado por cualquier método conocido y el vector recombinante obtenido se puede usar para transformar células de E. coli, Bacillus subtilis, levadura, animales o similares, por lo que sería posible la expresión de la proteína en masa mediante el uso de estas células recombinantes. Cuando se usa traducción in vitro para producir la proteína de la presente invención,... [Seguir leyendo]

(b) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2, en donde el extremo 3 de (a) está unido al extremo 5 de (b). 2. Un ADN que consiste en una parte del ADN de la reivindicación 1 en donde dicha parte comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 3, o un complemento de la misma y que se puede usar como una sonda para el diagnóstico genético. 3. Una proteína que consiste en SEQ ID NO: 2. ES 2 367 767 T3 4. Un péptido que consiste en una parte de la proteína de SEQ ID NO: 2 en donde dicho péptido comprende 5 residuos de aminoácidos o más de dicha secuencia y que se puede usar como un antígeno para preparar un anticuerpo. 5. Un anticuerpo contra el péptido de la reivindicación 4. 6. Un método in vitro para el diagnóstico de artritis reumatoide, que comprende la detección del ARNm complementario al ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o la proteína de la reivindicación 3, o el péptido de la reivindicación 4, en una muestra biológica. 8 ES 2 367 767 T3 Figura 1 9