Casete de expresión de ADN que comprende una región de iniciación de transcripción,

una secuencia de codificación de autoantígeno que codifica al menos una porción de un autoantígeno y una región de terminación de la transcripción,

Comprendiendo la región de iniciación de la transcripción un promotor,

para su utilización en el tratamiento de la diabetes mellitus dependiente de la insulina en un huésped humano mediante inyección intramuscular, en el que dicho autoantígeno se asocia con la diabetes mellitus dependiente de la insulina y dicho tratamiento estabiliza o mejora los síntomas clínicos de dicho humano

Vacunación por ADN para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Introducción

La complejidad del sistema inmunológico ha sido un obstáculo desalentador para la comprensión de la disfunción del sistema inmunológico. En los últimos años, las técnicas de biología molecular han proporcionado información sobre los mecanismos y componentes que subyacen a la inmunidad. En gran medida, la historia de la inmunidad es la historia de los linfocitos. Los linfocitos tienen un sistema extremadamente complejo y sutil para interactuar entre sí, con células que presentan antígeno, y con los antígenos y células extraños.

La modulación de la respuesta inmune varía con los factores específicos producidos, y los receptores presentes en la célula respondedora. Las vías para la disminución de las respuestas son tan importantes como las requeridas para la activación. La tolerancia de células T es un mecanismo conocido para la prevención de una respuesta inmunitaria a un antígeno en particular. Otros mecanismos, tales como la secreción de citocinas de supresión, también son conocidos.

Una característica común en una serie de enfermedades y afecciones inflamatorias es la participación de células CD4⁺T pro-inflamatorias. Estas células T son responsables de la liberación de las citocinas inflamatorias, de tipo Th1. Citocinas caracterizadas como tipo Th1 incluyen interleucina 2 (IL-2), ?-interferón, TNFa e IL-12. Estas citocinas pro-inflamatorias actúan para estimular la respuesta inmune, resultando en muchos casos en la destrucción del tejido autólogo. Citocinas asociadas con la supresión de la respuesta de células T son del tipo Th2, e incluyen IL-10, IL-4 y TGF-ß. Se ha encontrado que las células T de tipo Th1 y Th2 pueden utilizar el receptor de antígeno idéntico como res- puesta a un inmunógeno, en la primera produciendo una respuesta estimulante y en la segundo una respuesta supresiva.

Las citocinas desempeñan un papel crítico en el desarrollo y la recuperación de las enfermedades autoinmunes. Citocinas Th1 como la interleuquina 12 (IL12) y el interferón gamma (IFN?) se han encontrado en el sistema nervioso central (SNC) de pacientes de esclerosis múltiple (EM), así como en animales con EAE (Issazadeh et al. (1995). J Neuroimmunol 61:205-12). Citocinas Th2 como IL4, IL5 y IL10 se han encontrado que estaban elevadas, ya sea durante la remisión de la EM o EAE (Waisman et al. (1997) Immunointervention in autoimmunity by Th1/Th2 regulation, Adorini L., ed. (Austin, Texas: R. G. Landes Co.), pp. 129-50). Estudios anteriores han demostrado que la administración sistémica de IL4, así como la administración CNS local de IFN? pueden reducir la gravedad de la EAE (Racke et al. (1994) J Exp Med 180:1961-6; Voorthuis, et al (1990) Clin Exp Immunol 81:183-8). Además, la adición de IL4 a las células T naive puede resultar en el desarrollo de células de tipo Th2, mientras que la adición de IL12 puede resultar en el desarrollo de células de tipo Th1 (Macatonia et al. (1993) Int Immunol 5:1119-28).

La vacuna de ADN es eficaz en la protección de los animales de experimentación contra los patógenos infecciosos y el cáncer, y recientemente se ha usado para prevenir las enfermedades autoinmunes (Waisman et al. (1996) Nat Med 2, 899-905). La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo animal prototipo de la autoinmunidad de células T, refleja muchas de las características clínicas y patológicas de la enfermedad esclerosis múltiple humana.

Con el fin de modificar la respuesta inmune a las vacunas de ADN, la co-vacunación de ADN se ha realizado con genes de citocinas, junto con los genes de ciertos patógenos. Los ejemplos incluyen la inmunización con ADN con los antígenos de la hepatitis B y DNA IL2 con respuestas Th1 mejoradas, antígenos del VIH con ADN IL12 que actividad citotóxica mejorada de las células T, y antígenos de la gripe con IL6 ADN con actividad anti-viral mejorada (véase, por ejemplo, Chow et al. (1998) J Immunol 160 (3):1320-9).

La vacunación de ratones con ADN desnudo que codifica la cadena principal receptor de la célula T (TCR) ß que se reordenará en células T reactivas de la proteína básica de la mielina (MBP), se ha demostrado que protege a los ratones de la EAE. Esta inmunización indujo un patrón de producción de citocinas Th2 por las células T reactivas a la mielina, creando un ambiente de supresión que bloquea la autoinmunidad: las células T que reaccionan a la mielina autoantígeno desviado de un tipo ayudante T agresivo 1 (Th1) a un tipo Th2 represivas.

El desarrollo adicional de un tratamiento que inhibe específicamente la activación de células T sería de gran utilidad médica.

Literatura relevante

Waisman et al. (1996) Nat. Med. 2:899-905 y) Offner et al. (1998) J. Immunol. 161:2178-2186 describen el uso de la vacuna de ADN para evitar encehalomyelitis autoinmune experimental (EAE). La inyección de ADN para promover la vacunación contra los microbios y los tumores se discute en Cohen et al. (1997) Hosp. Pract. 32:169-171; Syrengelas, et al. (1996) Nat. Med. 2:1038-1041; Ulmer et al. (1996) Curr Opin Immunol. 8:531-536.; Pardoll et al. (1995) Inmunity 3:165-169; Davis et al. (1993) Hum. Mol. Genet. 2:1847-1851; Ulmer et al. (1993) Science 259:1745-1749 y Tang et al. (1992) Nature 356:152-154. La inmunización genética ha demostrado inducción tanto de una respuesta humoral específica, sino también de una reacción inmune celular más amplia en modelos animales de cáncer, micoplasma, tuberculosis, malaria y muchas infecciones de virus, incluyendo la influenza y el VIH. Véase, por ejemplo, Mor et al. (1995) J Immunol 155:2039-46; Xu y Liew (1995) Immunology 84:173-6 y Davis et al. (1994) Vaccine 12:1503-9.

La susceptibilidad a la esclerosis múltiple (EM) ha sido asociada con ciertos genes MHC de clase II, Oksenberg y Steinman (1990) Current Opinion in Immunology 2:619-621. En el nivel celular, oligoclonalidad de las células T se ha descrito en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con EM, Lee et al., Ann. Neurol. 29:33-40 (1991).

Los antígenos del SNC, incluyendo proteínas de la mielina, estudiados en el contexto de la EM se discuten en el de Rosbo et al., J. Autoimmunity 11:287-299 (1998). Potenciadores de la respuesta inmune a las vacunas de ADN incluyen CpG metilados dinucleótidos, Krieg et al. (1998) Trends Microbiol. 6:23-27, y secuencias fusionadas derivadas del patógeno, King et al. (1998) Nat. Med. 4:1281-1286.

El documento WO94/23737 describe los problemas de tratamiento de enfermedades autoinmunes, y describe el tratamiento de estas enfermedades mediante la administración de los péptidos autoantigénicos junto con un adyuvante. Kolodka et al. (1995) PNAS 11 de abril, vol. 92 no. 8: 3293-3297 describe una terapia génica para la diabetes mellitus tipo I en ratas con una participación de retrovirus para estimular el bajo nivel de expresión del gen de la insulina 1 de rata mediante las células del hígado. WO97/046253 describe un tratamiento para la enfermedad autoinmune basado en la entrega de antígeno, o antígeno de codificación de ADN a través de una "pistola de genes". Urbanek-Ruiz et al. (2001) Clinical Immunology, Vol. 100, nº 2, pp.164-171 describe el uso de la vacuna de ADN en la prevención de las enfermedades autoinmunes.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un casete de expresión de ADN que comprende una región de iniciación de la transcripción, una secuencia de codificación autoantígeno de codificación, al menos, una parte de un autoantígeno y una región de terminación de la transcripción, la región de iniciación de la transcripción que comprende un promotor, para su uso en el tratamiento de la diabetes mellitus insulino-dependiente en un huésped humano por inyección intramuscular donde dicho autoantígeno se asocia con diabetes mellitus insulino-dependiente y dicho tratamiento estabiliza o mejora los síntomas clínicos de dicho humano.

El autoantígeno puede ser una proteína humana endógena. Por ejemplo, el autoantígeno puede ser insulina, proinsulina, decarboxilasa del ácido glutámico 65 o antígeno de células de los islotes. La citocina Th2 puede ser IL-4 (por ejemplo, IL-4 humana), IL-10 o TGF-ß.

El casete de expresión de ADN pueden estar presente en un vector, como un vector plásmido. El vector puede comprender además un segundo casete de expresión de ADN que...

1. Casete de expresión de ADN que comprende una región de iniciación de transcripción, una secuencia de codificación de autoantígeno que codifica al menos una porción de un autoantígeno y una región de terminación de la transcripción,

Comprendiendo la región de iniciación de la transcripción un promotor,

para su utilización en el tratamiento de la diabetes mellitus dependiente de la insulina en un huésped humano mediante inyección intramuscular, en el que dicho autoantígeno se asocia con la diabetes mellitus dependiente de la insulina y dicho tratamiento estabiliza o mejora los síntomas clínicos de dicho humano.

2. Casete de expresión de ADN para su utilización según la reivindicación 1, en donde dicho autoantígeno es una proteína humana endógena.

3. Casete de expresión de ADN para su utilización según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho autoantígeno es insulina, proinsulina, decarboxilasa 65 de ácido glutámico o antígeno de células de islotes.

4. Casete de expresión de ADN para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el casete de expresión está presente en un vector.

5. Casete de expresión de ADN para su utilización según la reivindicación 4, en donde dicho casete de expresión de ADN está en un vector plásmido.

6. Casete de expresión de ADN para su utilización según la reivindicación 4 ó 5, en el que el vector también comprende un segundo casete de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica una citocina Th2 bajo el control regulador de un promotor que es activo en dicho huésped humano.

7. Casete de expresión de ADN para su utilización según la reivindicación 4 ó 5, que también comprende la utilización de un segundo casete de ADN de expresión que comprende una segunda secuencia que codifica una citocina Th2 bajo el control regulador de un promotor que es activo en dicho huésped humano, estando presente el casete un constructo de ADN separado.

8. Casete de expresión de ADN para su utilización según la reivindicación 7, en el que dicho constructo de expresión que codifica de dicha citocina Th2 y dicho constructo de expresión que codifica por lo menos una porción de un autoantígeno están coformulados.

9. Casete de expresión de ADN para su utilización según la reivindicación 7, en el que dicho constructo de expresión que codifica dicha citocina Th2 y dicho constructo de expresión que codifica por lo menos una porción de un autoantígeno se formulados de forma independiente.

10. Casete de expresión de ADN para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicha citocina Th2 es IL-4, IL-10 o TGF-ß.

11. Casete de expresión de ADN para su utilización según la reivindicación 10, en el que dicha IL-4 es IL-4 humana.

12. Casete de expresión de ADN para su utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el casete se administra en una serie de por lo menos dos inyecciones administradas por lo menos con 24 horas de diferencia.