FUSIONES DE FC CON RECEPTOR PARA FGF SOLUBLE MODIFICADAS CON ACTIVIDAD BIOLÓGICA MEJORADA.

Fusiones de Fc con receptor con receptor para FGF soluble modificadas con actividad biológica mejorada Campo de la invención e Introducción La invención se refiere a fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas que comprenden una fusión de un fragmento o dominio soluble del receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, que tienen actividad biológica mejorada, composiciones que las contienen, y método para producir tales moléculas de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificadas. Particularmente, las fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas han mejorado la actividad anti-angiogénica y las actividades de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos anti-tumorales, concretamente ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) y/o CDC (citotoxicidad dependiente de complemento), y son así útiles en el tratamiento de cáncer, tumores metastáticos y para reducir el crecimiento tumoral en un sujeto. La invención se refiere además a dichas fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas para usar en la inhibición del crecimiento tumoral y para el tratamiento o prevención de situaciones patológicas que incluyen, aunque no están limitadas a, cáncer de mama, melanoma, leucemia, metástasis cerebral, cáncer renal, melanoma primario, cáncer de colon primario, cáncer de vesícula primario, hemangioma infantil, cáncer de ovario, cáncer de próstata y cáncer de pulmón. Antecedentes y Relevancia de la Invención ES 2 366 160 T3 La angiogénesis, es decir, la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los pre-existentes, implica una compleja coordinación de proliferación de células endoteliales, migración, degradación de la membrana basal, y organización de los nuevos vasos (Ji et al., 1998, FASEB J. 12:1731-1738). La liberación local, incontrolada, de factores de crecimiento angiogénicos y/o alteraciones de la producción de inhibidores angiogénicos naturales, con una posterior alteración del balance angiogénico (Hanahan et al, 1996, Cell. 86: 353-64) son responsables de la proliferación incontrolada de células endoteliales que tiene lugar durante la neovascularización tumoral y en las enfermedades dependientes de angiogénesis (Folkman, 1995, Nat. Med. 1:27-31). Se han identificado numerosos inductores naturales de angiogénesis, incluyendo miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas, que transforman el factor de crecimiento y ß (TGF- y ­ ß), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factor-a de necrosis tumoral (TNF- a), interleuquinas, quemocinas, y los miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Estos potentes factores angiogénicos están a menudo sobre-expresados por tejidos tumorales (Presta, 2005, Cytokine & Growth Factors Reviews. 16: 159-178; Grose, 2005, Cytokine & Growth Factors Reviews. 16: 179-186). De hecho, los FGFs, y más especialmente FGF2, están sobre-expresados en numerosos cánceres humanos que incluyen melanoma (Halaban, 1996, Semin Oncol. 23:673-81; Hanada, 2001, Cancer Res. 61: 5511-5516), leucemia (Krejci et al, 2001 Leukemia. 15:228-37, Bieker et al, 2003, Cancer Res. 63: 7241-7246), cáncer renal (Hanada, 2001, Cancer Res. 61: 5511-5516), cáncer de colon (Tassi, 2006, Cancer Res. 66:1191-1198), cáncer de ovario (Whitworth et al, 2005, Clin Cancer Res. 11:4282-4288, Gan et al, 2006, Pharm Res. 23:1324-31), cáncer de próstata (Aigner et al, 2002 Oncogene, 21:5733-42; Kwabi-Addo et al, 2004, Endocr Relat Cancer. 11:709-24) y cáncer de pulmón (Takanami et al, 1996, Pathol Res Pract. 192:1113-20; Volm et al, 1997, Anticancer Res. 17:99­ 103; Brattstrom et al, 1998, Anticancer Res. 18: 1123-1127). Además, la sobre-expresión de FGF2 puede correlacionarse con una quimioresistencia en ciertos cánceres que incluyen cánceres de vejiga, mama, cabeza y cuello (Gan et al, 2006, Pharm Res. 23:1324-31). Con respecto a los miembros de la familia de FGF, como los FGFs secretados por células tumorales tienen afinidades por las cadenas laterales de glicosaminoglicanos de los proteoglicanos de la superficie y matriz celular, estos FGFs secretados se retienen más probablemente cerca de células tumorales que forman depósitos de FGF. Esta particularidad hace que el FGF dirija una buena estrategia para dirigir una molécula activa que necesita una molécula diana expresada de forma estable y fácilmente accesible. Diversos productos basados en anticuerpos se usan normalmente como fármacos terapéuticos y diversos anticuerpos monoclonales (mAbs) están aprobados actualmente en diversas áreas terapéuticas tales como oncología, inflamación, enfermedad infecciosa y enfermedad cardiovascular. Estos mAbs inducen la matanza de células tumorales mediante múltiples mecanismos que incluyen el reclutamiento del sistema inmune (Harris, 2004, Lancet Oncol, 5: 292-302). El resto Fc de los mAbs es responsable de estas funciones inductoras mediadas de forma inmune que incluyen dos mecanismos principales: Citotoxicidad mediada por Células Dependientes de Anticuerpos (ADCC) y Citotoxicidad Dependiente del Complemento (CDC). ADCC se da cuando un mAb se enlaza primero por medio de su sitio de enlace a antígeno a su diana en las células tumorales, y después la parte Fc se reconoce mediante receptores Fc específicos (FcR) en las células inductoras (es decir, NK, neutrófilos, macrófagos...) que atacan a la célula diana. CDC es un proceso donde una cascada de proteínas complemento diferentes se activan cuando un mAb se enlaza a C1q llevando a la formación de C3b en la superficie de células tumorales recubiertas con anticuerpos cerca del sitio de activación del complemento. La presencia de C3b controla la formación del complejo de ataque a la membrana C5-C9 que puede insertarse en la membrana para lisar células tumorales (Sharkey, 2007, CA Cancer J Clin, 56: 226-243). La capacidad de los mAbs para estimular ADCC depende de su isotipo. Los anticuerpos IgG1 e IgG3 enlazan fuertemente con FcRs, mientras que los anticuerpos IgG4 e IgG2 enlazan débilmente. La capacidad CDC de mAb también depende del isotipo de mAb. IgG3 y, en menor 2 grado, IgG1 son los isotipos más eficaces para estimular la cascada de complemente clásica. Los mAbs de IgG2 son menos eficaces en la activación de la cascada de complemento, mientras que IgG4 es incapaz de hacerlo (Strome, 2007, The Oncologist, 12:1084-1095). El uso de una proteína de fusión que puede tener, como los anticuerpos, una funcionalidad dual con una parte de enlace que muestra un reconocimiento específico y una parte inductora capaz de inducir la lisis de células diana por reclutamiento del sistema inmune, es un aspecto de estas estrategias terapéuticas. Además, para ser útil en terapia, esta molécula necesitaría tener propiedades farmacocinéticas PK ventajosas. El resto Fc puede aumentar de forma detectable la vida media en suero de la fusión Fc con receptor FGF soluble modificado, aunque hay aún una necesidad de proteína de fusión con una vida media en suero más larga. Finalmente, si esta proteína de fusión se va a usar como un fármaco, es necesario que se produzca de forma fiable, eficaz y con productividad apropiada. Así, hay una necesidad de una proteína de fusión con actividades ADCC y/o CDC que dirijan el FGF para el tratamiento de cáncer, tumores metastáticos y para reducir el crecimiento tumoral en un sujeto, con características PK mejoradas, y que pueda producirse de forma eficaz. Se han descrito diferentes fusiones Fc con receptores para FGF solubles en técnicas anteriores pero ninguna de ellas se produjeron en una línea celular modificada para mejorar sus propiedades (Powell, 2002, J. Biol. Chem, 277:28554-28563 ; Anderson, 1998, Hum. Mol. Genet., 7:1475-1483; documento WO00/46380). Los solicitantes han descubierto ahora que las proteínas de fusión solubles entre la parte del receptor para FGF soluble (resto de enlace o director) y la parte Fc (resto de función inductora) (sFGFR-Fc) que se modifican para tener un perfil glicano particular tienen, de hecho, actividades biológicas esencialmente mejoradas, que incluyen las actividades ADCC y/o CDC, y pueden usarse así como eficaces fármacos anti-angiogénicos y anti-tumorales, para el tratamiento de crecimiento celular incontrolado o cáncer. Estas proteínas de fusión solubles modificadas tienen ventajosas propiedades PK debido a su grado de sialilación, y pueden producirse con productividad apropiada y agregación mínima por su patrón de glicosilación. Resumen de la invención ES 2 366 160 T3 La presente invención está dirigida así a un Fc con receptor para FGF soluble modificado que comprende una fusión de un fragmento o dominio soluble de un receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, en donde al menos el 5º sitio de N-glicosilación del resto receptor... [Seguir leyendo]

1. Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada que comprende una fusión de un fragmento o dominio soluble de un receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, en donde el número promedio de ácido siálico por N-glicano del resto receptor para FGF es 0,9 o superior. 2. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 1, en donde el número promedio es ácido siálico por N-glicano del resto receptor para FGF es 1,2 o superior. 3. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 1 o 2, en donde como mucho el 45% de los N-glicanos de dicho resto receptor para FGF no tiene grupo sialilo. 4. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al menos el 5º sitio de N-glicosilación del resto receptor para FGF está ocupado. 5. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 4, en donde, además, los sitios 3º, 4º, 6º y 7º de glicosilación del resto receptor para FGF están ocupados. 6. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 5, en donde al menos 7 sitios de N-glicosilación del resto receptor para FGF están ocupados. 7. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 6, en donde todos los sitios de N-glicosilación del resto receptor para FGF están ocupados. 8. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquier reivindicación anterior, en donde el valor KD de dicha fusión para FGF2 medido por Biacore está comprendido entre 1 y 5 nM 9. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 8, en donde el valor KD de dicha fusión para FGF2 medida por Biacore es alrededor de 1,5 nM. 10. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha fusión posee actividades ADCC y/o CDC. 11. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los N-glicanos de dicha fusión están fucosilados al 60-100%. 12. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada comprende 3 residuos de manosa, una media de 1,5 a 3,0 residuos de galactosa, una media de 3,5 a 5 residuos de N-acetilglucosamina, y una media de 0,6 a 1 residuos de fucosa por molécula de glicano. 13. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde los N-glicanos de dicha fusión están fucosilados al 0-60%. 14. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el receptor para FGF se selecciona entre receptor para FGF 1 (FGFR1) o receptor para FGF 2 (FGFR2). 15. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el receptor para FGF se selecciona entre isotipo IIIc de receptor para FGF 1 e isotipo IIIc de receptor para FGF 2. 16. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio soluble de receptor para FGF tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 4, o bien una secuencia que tiene una identidad de al menos 95% con la SEQ ID NO: 4. 17. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la parte Fc tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 6, o bien una secuencia que tiene una identidad de al menos 95% con la SEQ ID NO: 6. 18. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada comprende además una secuencia enlazadora de al menos 3 residuos aminoácido. 19. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 18, en donde la secuencia enlazadora es SAL (Ser-Ala-Leu). 20. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada tiene una secuencia polipeptídica como se expone en SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 95% con la SEQ ID NO: 2. 48 ES 2 366 160 T3 21. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada comprende además el péptido señal de SEQ ID 22. Una célula huésped que comprende (i) un ácido nucleico que codifica el receptor para FGF de fusión modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, (ii) un ácido nucleico que codifica -1,4galactosiltransferasa y (iii) un ácido nucleico que codifica ß-2,3-sialiltransferasa. 23. La célula huésped según la reivindicación 22, en donde dicho ácido nucleico que codifica el receptor para FGF de fusión modificado comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. 24. La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, como un medicamento. 25. Una composición farmacéutica que comprende un receptor para FGF de fusión modificado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21. 26. La composición farmacéutica según la reivindicación 25, en donde dicha composición contiene un agente terapéutico adicional. 27. La composición farmacéutica según la reivindicación 26, en donde dicho agente terapéutico adicional es un agente anti-angiogénico o un agente quimioterapéutico. 28. La composición farmacéutica según la reivindicación 27, en donde dicho agente anti-angiogénico es un factor de necrosis tumoral, o un antagonista de un factor de crecimiento fibroblástico (FGF) ácido o básico, factor de crecimiento hepatocítico (HGF), factor tisular (TF), proteína C, proteína S, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o receptor HER2. 29. La composición farmacéutica según la reivindicación 27, en donde dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo: agentes antimicrotúbulos; complejos de coordinación con platino; agentes alquilantes; agentes antibióticos; inhibidores de topoisomerasa II; antimetabolitos; inhibidores de topoisomerasa I; hormonas y análogos de hormonas; inhibidores de la ruta de transducción de señal: inhibidores de angiogénesis de tipo distinto al de receptor de tirosina-quinasa; agentes inmunoterapéuticos; agentes pro-apoptóticos; e inhibidores de la señalización del ciclo celular. 30. La composición farmacéutica según la reivindicación 27, en donde dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo de taxol y taxotere. 31. Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para usar en el tratamiento de cáncer. 32. Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 31 en asociación con un agente terapéutico adicional. 33. Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 32, en donde dicho agente terapéutico adicional es un agente anti-angiogénico o un agente quimioterapéutico. 34. Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 33, en donde dicho agente anti-angiogénico es un factor de necrosis tumoral, o un antagonista de un factor de crecimiento fibroblástico (FGF) ácido o básico, factor de crecimiento hepatocítico (HGF), factor tisular (TF), proteína C, proteína S, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o receptor HER2. 35. Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 33, en donde dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo: agentes antimicrotúbulos; complejos de coordinación con platino; agentes alquilantes; agentes antibióticos; inhibidores de topoisomerasa II; antimetabolitos; inhibidores de topoisomerasa I; hormonas y análogos de hormonas; inhibidores de la ruta de transducción de señal; inhibidores de angiogénesis de tipo distinto al de receptor de tirosina quinasa; agentes inmunoterapéuticos; agentes proapoptóticos; e inhibidores de la señalización del ciclo celular. 36. Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 33, en donde dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo de taxol y taxotero. 37. Una fusión Fc con receptores para FGF soluble modificada según la reivindicación 31, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo de carcinoma, que incluye el de vejiga, mama, colon, cabeza y cuello, riñón, que incluye carcinoma de células renales, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello de útero, tiroides y piel; que incluye carcinoma de células escamosas ; tumores hematopoyéticos de trazado linfático, que incluye leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda , linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de trazado mieloide, incluidos leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; otros tumores, que 49 ES 2 366 160 T3 incluyen melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, que incluyen astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores, que incluyen melanoma, xeroderma pigmentoso, keratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma. 5 38. Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 37, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo de melanoma, leucemia, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama y cáncer de cabeza y cuello. 39. El proceso de preparación de una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que consiste en cultivar una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 22 o 23 y en cosechar la proteína secretada. ES 2 366 160 T3 51 ES 2 366 160 T3 52 ES 2 366 160 T3 53 ES 2 366 160 T3 54 ES 2 366 160 T3 ES 2 366 160 T3 56 ES 2 366 160 T3 57 ES 2 366 160 T3 58 ES 2 366 160 T3 59 ES 2 366 160 T3 ES 2 366 160 T3 61 ES 2 366 160 T3 62 ES 2 366 160 T3 63 ES 2 366 160 T3 64 ES 2 366 160 T3 ES 2 366 160 T3 66 ES 2 366 160 T3 67 ES 2 366 160 T3 68 ES 2 366 160 T3 69 ES 2 366 160 T3 ES 2 366 160 T3 71 ES 2 366 160 T3 72 ES 2 366 160 T3 73