CEBADORES Y SONDAS PARA DETECTAR GENOTIPOS DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO GENITAL.

Ewq onjunto (array) de nucleótidos para la detección y/o determinación del genotipo de un virus de papiloma humano existente en una muestra biológica,

que consta de un soporte sólido con una superficie y por lo menos un primer oligonucleótido o molécula de ácido nucleico unido a dicha superficie del soporte, dicho oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es idóneo en calidad de sonda para el análisis del gen E1 del HPV o de una parte del mismo, para la detección y determinación de un genotipo de HPV humano genital, elegido entre el grupo formado por: a) oligonucleótidos específicos del genotipo HPV que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, b) oligonucleótidos, que presentan una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a uno de los oligonucleótidos del apartado a), a saber, una deleción o adición de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos descritas en el apartado a), c) oligonucleótidos, que presentan una secuencia de nucleótidos, que en toda su longitud es complementaria de la secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido según el apartado a) o b), d) moléculas de ácido nucleico que constan por lo menos de una región, que posee una de las secuencias de nucleótidos definidas en los apartados de a) a c) y una o más regiones adicionales de una longitud total por lo menos de un nucleótido y e) mezclas de los oligonucleótidos según los apartados de a) a c) y/o de moléculas de ácido nucleico según el apartado d)

La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección y/o la determinación de genotipos de HPV genital, a conjuntos (arrays) de nucleótidos que abarcan a oligonucleótidos y moléculas de ácidos nucleicos y a kits así como al uso de oligonucleótidos y moléculas de ácido nucleico para la amplificación o detección y/o determinación de geno-tipos de HPV genital, para el diagnóstico y/o detección precoz de enfermedades y para la fabricación de productos de diagnóstico de enfermedades.

Las infecciones del virus de papiloma patogénico humano muy propagado entre la población pertenecen a las enfermedades virales de transmisión sexual más frecuente. Sin embargo, el contagio puede realizarse también a los recién nacidos durante el período previo al nacimiento. Como secuelas de una infección del HPV aparecen en la piel síntomas normalmente inofensivos. Hasta el presente se han detectado unos cien tipos diferentes de este virus. Los virus de papiloma se dividen en tipos cutáneos, que provocan lesiones sobre todo en el epitelio queratinizante y en tipos de mucosa, que infectan en especial las mucosas. Otra subdivisión se realiza en tipos asociados con lesiones benignas (low risk types; tipos de riesgo bajo) y tipos que llevan asociadas alteraciones epiteliales preneoplásicas y malignas (high risk types; tipos de alto riesgo). Los tipos de alto riesgo conocidos son por ejemplo los tipos 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82. Los tipos de HPV de riesgo bajo conocidos son por ejemplo los tipos 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57 y MM8.

Unos 25 tipos de virus de papiloma guardan relación causal con enfermedades del ámbito genital de la mujer. Las infecciones del HPV se manifiestan en la región ano-genital de la mujer, en especial en forma de lesiones condilomatosas, displásicas y neoplásicas. Dado que aprox. el 99,7 % de los carcinomas de cuello uterino contienen el DNA del virus de papiloma, ahora ya se acepta en general que los virus de papiloma humano constituyen factores de riesgo necesarios para la aparición de esta afección cancerosa. Lo estudios epidemiológicos y moleculares han puesto de manifiesto que una infección duradera con los tipos de HPV de alto riesgo, en especial con los tipos de HPV 16 y 18, participa de modo determinante en la aparición del carcinoma de cuello uterino.

Tanto el cáncer de cuello uterino como las demás afecciones cancerosas, que epidemiológicamente se asocian con el virus de papiloma, por ejemplo determinadas formas del cáncer de piel, son enfermedades evitables, cuando se puede asegurar una detección precoz y el correspondiente tratamiento. Un procedimiento fiable de diagnóstico de una infección de HPV ya existente es, pues, un requisito indispensable para realizar una terapia específica.

Desde el punto de vista del diagnóstico cabe distinguir

entre tres formas de la infección del HPV, a saber, las in

fecciones de HPV clínicas, subclínicas y latentes. Las alteraciones epiteliales asociadas con el HPV del estadio subclínico o clínico de la infección pueden analizarse relativamente bien a nivel citológico. Las estadios iniciales del carcinoma de cuello uterino se detectan, pues, actualmente sobre todo tomando un frotis de la porción intravaginal de la cérvix (portio) o del cuello uterino en combinación con una colposcopia. Aunque los procedimientos citológicos contribuyen a que la incidencia de los carcinomas de cuello uterino hayan disminuido significativamente en los últimos años, no proporcionan resultados completamente satisfactorios. No es posible un pronóstico sobre el desarrollo posterior de las lesiones concretas. Por lo demás, los procedimientos citológicos adolecen de errores subjetivos relativamente grandes y no se han estandarizado.

Dado que el cultivo y la propagación en cultivo del HPV no es posible, la detección del HPV en el laboratorio se basa en especial en la detección del DNA viral o de las proteínas de envoltorio. Mientras la tinción inmunohistoquímica se pueden identificar por ejemplo antígenos específicos de grupos (antígenos de cápside) de los virus de papiloma. Pero este ensayo tiene poca sensibilidad y por tanto poco poder predictivo. Tampoco los análisis serológicos para detectar los anticuerpos específicos del HPV en el suero de los pacientes tienen importancia para el diagnóstico, porque incluso entre los pacientes que tienen carcinoma de cuello uterino solamente en el 50 % de todos los casos se consigue detectar los

anticuerpos.

Una gran importancia para el diagnóstico tienen los procedimientos de detección de ácidos nucleicos virales en pruebas clínicas de tejidos. Son especialmente importantes los procedimientos, que permiten distinguir entre los tipos individuales de una infección de HPV de riesgo bajo o de riesgo elevado, ya que solamente están asociados “in situ” con el desarrollo del carcinoma de cuello uterino los tipos de HPV siguientes: el HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68 y HPV82, aunque probablemente también el HPV53 sea cancerígeno.

Un procedimiento conocido de detección de ácidos nucleicos del HPV es el procedimiento HCM (Hybrid Capture Microplate) de la empresa Digene (HC2 HPV DNA-Test), que se basa en un procedimiento de hibridación que amplifica las señales. Como sondas de hibridación se utilizan las secuencias de RNA específicas del HPV. Después de la incubación de las sondas con DNA de HPV desnaturalizado procedente de tejidos infectados se fijan los híbridos de RNA/DNA formados mediante anticuerpos específicos sobre la superficie de las microplacas. La detección de los híbridos RNA/DNA se realiza mediante un segundo anticuerpo, que está marcado con una fosfatasa alcalina. Esta enzima es capaz de generar una luz medible después de la adición de determinadas sustancias. El procedimiento HCM permite la diferenciación específica de subgrupos entre los tipos de riesgo bajo 6, 11, 42, 43 y 44 y los tipos de riesgo elevado 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 y por ello puede ser útil para el diagnóstico diferencial de datos citológicos poco claros. De todos modos, este procedimiento tiene el inconveniente de que no detecta algunos tipos de alto riesgo y además en él se produce una reacción cruzada entre los dos subgrupos.

Muchos procedimientos conocidos del estado de la técnica para la detección de ácidos nucleicos virales en muestras clínicas de tejidos se basan en la amplificación previa del gen del HPV. El procedimiento más sensible ha demostrado ser el procedimiento de la PCR. Con este procedimiento puede detectarse un espectro relativamente amplio de virus HPV, que después pueden someterse a una tipificación, dicha tipificación se efectúa principalmente por análisis de la secuencia del producto de la amplificación por PCR. La tipificación permite la caracterización exacta del tipo de HPV no solo en el caso de una infección única, sino también en el caso de una infección múltiple o mixta y, de este modo, permite realizar una evaluación del potencial oncológico del genotipo de HPV detectado, más allá de los datos citológicos obtenidos.

Snijders y col., J. Gen. Virol. 71, 173-181, 1990 y Surentheran y col., J. Clin. Path. 51, 606-610, (1998) describen procedimientos de PCR para la detección del DNA del HPV empleando para ello pares de cebadores, que están situados dentro del gen L1 de la estructura del HPV. A continuación se secuencia el fragmento del gen amplificado para realizar la tipificación de los tipos de HPV detectados. Sin embargo, el inconveniente de ambos procedimientos estriba en que el gen L1 se conserva menos bien que otras regiones del DNA del HPV. Por tanto, con los procedimientos descritos solamente se puede detectar un número limitado de tipos de HPV. Con los ceba-dores descritos por Snijder y col., se pueden detectar, por ejemplo, algunos tipos de HPV, tales como el HPV30, HPV39 y HPV51, pero con una sensibilidad muy reducida. Además, algunos tipos de HPV, por ejemplo el HPV18, generan bandas adicionales cuando se emplean los cebadores descritos por Snijder y col.

En el documento DE 100 09 143 A1 se describe un procedimiento de PCR para detectar una infección general de HPV, pero en especial del DNA del HPV en la región anogenital, en él se emplean 2 pares de cebadores, situados dentro del gen E1 conservado del HPV. De todos modos, para una tipificación segura solamente se pueden emplear los productos de amplificación obtenidos empleando el un par de cebadores, pero no los productos de amplificación...

Ewq onjunto (array) de nucleótidos para la detección y/o determinación del genotipo de un virus de papiloma humano existente en una muestra biológica, que consta de un soporte sólido con una superficie y por lo menos un primer oligonucleótido o molécula de ácido nucleico unido a dicha superficie del soporte, dicho oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es idóneo en calidad de sonda para el análisis del gen E1 del HPV o de una parte del mismo, para la detección y determinación de un genotipo de HPV humano genital, elegido entre el grupo formado por:

a) oligonucleótidos específicos del genotipo HPV que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135,

b) oligonucleótidos, que presentan una secuencia de nucleótidos mutada con respecto a uno de los oligonucleótidos del apartado a), a saber, una deleción o adición de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos descritas en el apartado a),

c) oligonucleótidos, que presentan una secuencia de nucleótidos, que en toda su longitud es complementaria de la secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido según el apartado a) o b),

d) moléculas de ácido nucleico que constan por lo menos de una región, que posee una de las secuencias de nucleótidos definidas en los apartados de a) a c) y una o más regiones adicionales de una longitud total por lo menos de un nucleó

tido y

e) mezclas de los oligonucleótidos según los apartados de a) a c) y/o de moléculas de ácido nucleico según el apartado d).

2. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 1, en el que el soporte tiene la forma de plaquita, por ejemplo la forma de un portaobjetos o forma de plaquita con hoyos, por ejemplo un cursor con cámaras o una placa de microvaloración que tenga las medidas recomendadas por la SBS (Society of Biomolecular Screening).

3. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 1 ó 2, en el que los primeros oligonucleótidos o moléculas de ácido nucleico de la superficie del soporte están dispuestos en una zona definida de análisis.

4. Conjunto de nucleótidos según una de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que la superficie del soporte tiene una zona de control.

5. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 4, en el que la zona de control consta de un control de orientación del soporte, un control de amplificación, un control de hibridación, un control de muestras y/o un control de impresión.

6. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 5, en el que el control de orientación del soporte consta por lo menos de un segundo oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.

7. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 6,

en el que el segundo oligonucleótido es un oligonucleótido fluorescente y el control de orientación del soporte consta

por lo menos de tres manchas del oligonucleótido fluorescente.

8. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 7, en el que el control de amplificación consta por lo menos de un tercer oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.

9. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 5, en el que el control de hibridación consta por lo menos de un cuarto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.

10. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 5, en el que el control de las muestras consta por lo menos de un quinto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.

11. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 10, en el que el quinto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es idóneo como sonda para la detección del gen ADAT1 humano.

12. Conjunto de nucleótidos según la reivindicación 5, en el que el control de impresión consta por lo menos de un sexto oligonucleótido o molécula de ácido nucleico.

13. Kit para la detección y/o determinación de genotipos de HPV genital, que consta por lo menos de un primer recipiente en el que se aloja por lo menos un cebador para la amplificación de las regiones del gen E1 del HPV, elegido entre los oligonucleótidos del grupo formado por un oligonucleótido, que puede utilizarse como cebador, en especial como cebador directo de la amplificación de una región de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital (HPV) y que tiene la secuencia 5'-CAR GCI AAA WWW KTD AAR GAY TGT G-3' o 5'-CAR GCN AAA WWW KTD AAR GAY TGT G-3' (SEQ ID NO 1), en las

que R es = A o G, W es = T o A, K es = T o G, I es = inosina, N es = A, T, G o C, D es = A, T o G e Y es = C o T, un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5'-CAR GCI AAA TAT KTR AAA GAT TGT G-3' o 5'-CAR GCN AAA TAT KTR AAA GAT TGT G-3' (SEQ ID NO 2), un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5'-CAR GCA AAA TAT GTW AAG GAT TGT G3' (SEQ ID NO 3), un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5'-CAR GCW AAA ATT GTA AAR GAT TGT G-3' (SEQ ID NO 4), un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5'-CAA GCA AAA ATA GTA AAR GAC TGT G-3' (SEQ ID NO 5), y un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5'-CAR GCA AAA TAT GTA AAA GAC TGT G-3' (SEQ ID NO 6), en las que en las SEQ ID NO de 2 a 6 R es = A o G, W es = T o A, K es = T o G, I es = inosina y N es = A, T, G o C, un oligonucleótido, que puede utilizarse como cebador, en especial como cebador inverso para la amplificación de una región de ácido nucleico de un virus de papiloma humano genital, que tiene la secuencia de nucleótidos 5'-ARY GGY TSY ARC CAA AAR TGR CT-3' (SEQ ID NO 7), en la que R es = A o G, Y es = C o T y S es = C o G, un oligonucleótido, que tiene una secuencia de nucleótidos, que está mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7 y que puede obtenerse por:

a) deleción de 1 a 10 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7,

b) adición de 1 a 10 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, y/o

c) sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7 y un conjunto de nucleótidos según una de las reivindicaciones de 1 a 12.

14. Kit según la reivindicación 13, que consta de dos recipientes primeros, de los que uno contiene cantidades equimolares de los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6 o secuencias mutadas de las mismas y otro recipiente que contiene un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7 o una secuencia de nucleótidos mutada de la misma.

15. Kit según la reivindicación 13, que consta de seis recipientes primeros, de los cuales cinco recipientes contienen en cada caso uno de los oligonucleótidos que tienen las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 2 a 6

o secuencias mutadas de los mismos y otro recipiente que contiene un oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos definida en la SEQ ID NO 7 o una secuencia de nucleótidos mutada de la misma.

16. Uso de un oligonucleótido que tiene una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, de un oligonucleótido, cuya secuencia de nucleótidos está mutada con respecto a una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, a saber, que presenta una deleción o adición de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos, de un oligonucleótido, que

presenta una secuencia de nucleótidos, que en toda su longitud es complementaria de una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO de 1 a 7, 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135 o de la secuencia mutada de las mismas; de una 5 molécula de ácido nucleico, que consta de una de las secuencias de nucleótidos definidas en las SEQ ID NO 19, 32, 41, 44, 48, 82 y de 117 a 135, una secuencia mutada de las mismas

o una secuencia complementaria de las mismas, para la obtención de un conjunto de oligonucleótidos según las reivindica

10 ciones de 1 a 12 o de un kit según las reivindicaciones de 13 a 15 para el diagnóstico de enfermedades causadas por el virus de papiloma humano genital.

17. Uso según la reivindicación 16, en el que el oligonucleótido o molécula de ácido nucleico es una molécula de

15 DNA, una molécula de RNA, una molécula de PNA, una molécula de LNA o una forma mixta de las mismas.

18. Procedimiento de detección y/o determinación del genotipo de un virus de papiloma humano existente en una muestra biológica, en el que se emplea un conjunto (array) de

20 nucleótidos según una de las reivindicaciones de 1 a 12 para dicha detección y/o determinación.