Modificación de la superficie.

Procedimiento para la modificacion al menos por zonas de una superficie de un soporte de al menos un sustrato mediante deposicion de un recubrimiento mediante polimerizacion por plasma,

generandose el recubrimiento al menos por zonas con espacios libres para acomodar al menos una solucion realizandose antes de o durante la polimerizacion por plasma una activacion de la superficie del sustrato en el plasma y generandose al menos por zonas un polimero de plasma hinchable, asi como formandose mediante el recubrimiento una estructura tridimensional, caracterizado porque en la activacion se realiza un acoplamiento de potencia de 5 a 20 veces mayor que en la polimerizacion por plasma.

Modificacion de la superficie La presente invencion describe el uso de un soporte de al menos un sustrato que presenta al menos por zonas un recubrimiento fabricado por polimerizacion por plasma de modulos individuales, asi como un procedimiento para su fabricacion.

En sistemas para la microfluidica o en productos de micromatrices para el analisis de muestras biologicas, el soporte o la superficie o la calidad de la superficie del soporte tiene una gran importancia. Los analisis de este tipo son frecuentemente muy laboriosos y requieren mucho tiempo y, por tanto, es especialmente importante que los ensayos usados para esto sean sensibles y fidedignos. Un cambio ventajoso para el uso puede conseguirse especialmente mediante modificaciones de la superficie como, por ejemplo, por cambio de la funcionalidad quimica.

Las superficies quimicamente modificas son indispensables, por ejemplo, en la industria farmaceutica para el desarrollo de sistemas de prueba biologicos, ya que mediante la provision especifica de la plataforma con capas definidas de unidades funcionales quimicas puede controlarse la interaccion superficie/biomolecula. La tecnologia de micromatrices tambien se basa en el uso de superficies quimicamente modificadas para la inmovilizacion de ADN (superficie de amina) o proteinas (superficie de aldehido, epoxidica) [M. Pirrung, Angew. Chem. 2002, 41, 1276. - N. Zammatteo y col., Analytical Biochemistr y 2000, 280, 143. - M. Shena: Microarrays, A practical approach, Oxford University Press 1999.]

Los analisis del genoma incluyen el uso de material biologico que comprende acidos nucleicos y proteinas, pudiendo realizarse en paralelo muchos analisis. Normalmente se inmovilizan biomoleculas por acoplamiento quimico o adsorcion. Actualmente se fabrican matrices con biomoleculas depositando alicuotas de muestra bajo condiciones que permiten que las moleculas se unan o sean unidas a la superficie de la matriz. Alternativamente o adicionalmente, las biomoleculas pueden sintetizarse sobre la superficie de la matriz o inmovilizarse directamente o indirectamente. El numero de muestras diferentes que se aplican sobre una matriz individual puede ser muy alto. La aplicacion puede facilitarse por impresoras de matriz. Las matrices son normalmente productos de un solo uso, por lo que en su produccion se desea conseguir un alto grado de reproducibilidad y un minimo de errores.

Para conseguir los efectos deseados se sabe manipular quimicamente soportes con muchas cavidades o dispositivos de microfluidica para mejorar la afinidad o retencion de moleculas seleccionadas en su superficie. A este respecto se desea unir la superficie tratada con la molecula diana con alta afinidad y retencion sin influir negativamente al mismo tiempo en su actividad biologica, de manera que pueda realizarse un ensayo reproducible.

Por el documento WO 01/031339 A1 se conoce la aplicacion de la polimerizacion por plasma. En ella, una pelicula de polimero reticulado ultrafina de aproximadamente 200 nm se deposita sobre un sustrato con funcionalidad quimica controlable. A este respecto, las propiedades del sustrato permanecen en gran medida sin afectar. Los plasmas o los gases ionicos se excitan normalmente por un campo electrico. Se trata de un medio quimico extraordinariamente reactivo que comprende iones, electrones, particulas neutras y radiacion electromagnetica. A presion reducida pueden alcanzarse condiciones a las que la temperatura de los electrones se diferencia claramente de la de los iones y las particulas neutras. H. K. Yasuda, Plasma Polymerisation, Academic Press, Londres, 1985, describieron que compuestos organicos (monomeros) se polimerizan puros o junto con otros gases, por ejemplo, argon, recubriendose tanto superficies en contacto con el plasma como tambien aguas abajo de la descarga. La polimerizacion por plasma es una ruta eficaz para la generacion libre de disolventes de finas capas (>5 nm) . La generacion de un plasma frio se produce a vacio por una descarga electrica, por la que se genera un entorno muy reactivo constituido por iones, radicales, electrones y particulas metaestables. Mediante la eleccion de condiciones de reaccion adecuadas como activacion, presion, entrada de potencia, gases portadores y compuestos de partida organicos (monomeros) puede conseguirse una polimerizacion del correactante y la deposicion del polimero de plasma formado sobre sustratos. Los polimeros de plasma se diferencian principalmente drasticamente de los polimeros convencionales debido a la falta de una unidad de repeticion continua, asi como de un alto grado de reticulacion. Un motivo de esto es la presencia de multiples especies reactivas en el plasma y de una menor selectividad resultante en comparacion con las rutas de sintesis convencionales. La condicion basica para el uso de posibles monomeros es la introduccion de precursores principalmente liquidos en la fase gaseosa bajo las condiciones de reaccion seleccionadas.

Asi, en el documento DE 603 04 163 T2 se describe una modificacion de la superficie por polimerizacion por plasma por la que se fabrica una superficie que es irregular y define zonas de la superficie locales. Esta superficie presenta una elevada afinidad por moleculas biologicas que estan expuestas a la superficie. Esto se consigue extrayendo una parte del plasma por una abertura. Alternativamente, un plasma puede excitarse en la punta o en un microcapilar.

Es objetivo de la presente invencion un soporte para inmovilizar acidos nucleicos con al mismo tiempo minimizacion de uniones no especificas de proteinas, asi como facilitar un procedimiento para su fabricacion.

El objetivo de la invencion se alcanza respectivamente independientemente por un soporte con un recubrimiento, presentando el recubrimiento al menos por zonas espacios libres para acomodar una solucion, y un procedimiento, generandose el recubrimiento al menos por zonas con espacios libres para acomodar la solucion.

Como espacios libres en relacion con la invencion se entiende tanto estructuras bi como tambien tridimensionales que presentan una alta capacidad de union para acidos nucleicos con al mismo tiempo union de proteinas minimizada. Para este modo de accion es decisiva tanto la estructura por las condiciones de sintesis que produce una matriz hinchable porosa como tambien las unidades funcionales quimicas aproticas polares para ayudar en la repelencia de proteinas unidas a modulos quimicos polares contiguos para la inmovilizacion selectiva de acidos nucleicos. La ventaja de la matriz hinchable porosa funcional en la inmovilizacion de los acidos nucleicos es la combinacion de a) componentes de union quimicos adecuados en la capa funcional con b) la elevacion de la capacidad de union debido a la penetracion del componente de union en la capa y, por tanto, tambien la inmovilizacion en la capa y no solo sobre la capa y c) la optimizacion de la tasa de inmovilizacion debido a la evaporacion retardada y, por tanto, tiempo de reaccion prolongado de las soluciones de la matriz. La ventaja de la matriz hinchable porosa funcional en la repelencia de proteinas es la combinacion de la formacion de la capa de hidrato del nanogel en contacto con soluciones tampon con modulos de sintesis aproticos incluidos que no participan en la union de proteinas. Por tanto, con la invencion se consigue un efecto sinergico con union de ADN mejorada y al mismo tiempo repelencia de proteinas.

Como solucion, en relacion con la invencion se entiende un liquido que puede interaccionar con los grupos funcionales de las finas capas generadas por plasma. Por esta se entiende, por ejemplo, un liquido que contiene ADN, ARN, PNA, LNA, etc.

La capa asi generada puede ser ventajosa para todas las aplicaciones que quieran unir acidos nucleicos, como ADN, ARN, PNA, LNA o una forma mixta de los mismos, y a este respecto se minimiza al mismo tiempo la union de proteinas como, por ejemplo, enzimas, anticuerpos, antigenos. Este es el caso en muchas reacciones de deteccion en las que se usan acidos nucleicos como sondas de captura. Las enzimas mas frecuentemente usadas son peroxidasa de rabano picante (HRP) , glucosa-oxidasa o fosfatasa alcalina, usandose estas tanto para reacciones de deteccion colorimetricas como tambien de quimioluminiscencia y fluorescencia. En el transcurso del analisis primero se usan analitos que estan marcados con un hapteno como, por ejemplo, biotina, antigeno, se hibridan, por ejemplo, con sondas de ADN. A continuacion se lava y una enzima que esta acoplada a una molecula de captura complementaria al hapteno, por ejemplo, estreptavidina, anticuerpo, se une al complejo analito-sonda. Despues de otra etapa de lavado, la enzima se anade al sustrato y se detecta el... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la modificacion al menos por zonas de una superficie de un soporte de al menos un sustrato mediante deposicion de un recubrimiento mediante polimerizacion por plasma, generandose el recubrimiento al menos por zonas con espacios libres para acomodar al menos una solucion realizandose antes de o durante la polimerizacion por plasma una activacion de la superficie del sustrato en el plasma y generandose al menos por zonas un polimero de plasma hinchable, asi como formandose mediante el recubrimiento una estructura tridimensional, caracterizado porque en la activacion se realiza un acoplamiento de potencia de 5 a 20 veces mayor que en la polimerizacion por plasma.

2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la activacion se realiza con una mezcla de reaccion que comprende un gas portador y un gas de reaccion en un reactor, siendo el gas portador un gas inerte y seleccionandose el gas de reaccion de un grupo que comprende oxigeno, amoniaco, H2, N2, CO2, C2H2.

3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado porque entre la activacion y la polimerizacion por plasma se introduce en el reactor un gas de lavado, especialmente en la camara de reaccion.

4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado porque el gas de lavado es un gas inerte.

5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la activacion y/o la polimerizacion por plasma se realiza a un acoplamiento de potencia de un intervalo con un limite inferior de 0, 1 W y un limite superior de 2500 W

6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la activacion y/o la polimerizacion por plasma se realiza a un acoplamiento de potencia de un intervalo con un limite inferior de 2 W, especialmente 5 W, y un limite superior de 1700 W, especialmente 300 W.

7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la activacion se realiza preferiblemente a una potencia de plasma de un intervalo con un limite inferior de 2 W y un limite superior de 2500 W y la polimerizacion por plasma a una potencia de plasma de un intervalo con un limite inferior de 0, 1 W y un limite superior de 400 W.

8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el recubrimiento se deposita por medio de plasmas pulsados.

9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la polimerizacion por plasma se realiza mediante la adicion de al menos una especie de monomero.

10. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la adicion de la al menos una especie de monomero se realiza en forma liquida y/o en forma gaseosa.

11. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la presion durante la activacion y/o la polimerizacion por plasma se selecciona de un intervalo con un limite superior de 1, 5 mbar (150 Pa) , preferiblemente 0, 5 mbar (50 Pa) , y un limite inferior de 0, 05 mbar (5 Pa) , preferiblemente 0, 2 mbar (20 Pa) .

12. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la activacion se realiza durante un periodo de tiempo con un limite inferior de 1 min, preferiblemente, 5 min, y un limite superior de 15 min, preferiblemente 10 min.

13. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la polimerizacion por plasma se realiza durante un periodo de tiempo con un limite inferior de 1, 5 min, preferiblemente, 10 min, y un limite superior de 60 min, preferiblemente 20 min.

14. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el reactor, especialmente la camara de reaccion, se lava con aire despues de la polimerizacion y se ventila la camara.

15. Uso de un soporte de al menos un sustrato que presenta al menos por zonas un recubrimiento fabricado por polimerizacion por plasma de modulos individuales que presenta al menos por zonas uno o varios espacios libres para acomodar al menos una solucion, es hinchable al menos por zonas y presenta al menos por zonas una estructura tridimensional, formando la capa hinchable una capa de hidrato para inmovilizar acidos nucleicos rechazando al mismo tiempo proteinas.

16. Uso de un soporte segun la reivindicacion 15, caracterizado porque el recubrimiento formado presenta angulos de contacto de un intervalo con un limite inferior de 35º y un limite superior de 65º con agua como liquido de medida.

17. Uso de un soporte segun la reivindicacion 15 o 16, caracterizado porque el recubrimiento presenta un espesor seleccionado de un intervalo con un limite inferior de 4 nm, preferiblemente 10 nm, y un limite superior de 300 nm, preferiblemente 40 nm.

18. Uso de un soporte segun una de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque el material del sustrato esta formado preferiblemente por plastico, por un grupo que comprende un polimero a base de carbono o silicio, por un grupo que comprende poliestireno (PS) , polietileno (PE) , poli (tereftalato de etileno) (PET, PETP, PBTP) , polipropileno (PP) , poli (cloruro de vinilo) (PVC) , poliamidas, nitrocelulosa, poli (metacrilato de metilo) (PMMA) , estireno-acrilonitrilo (SAN) , policarbonato (PC) , copolimeros de cicloolefina (COC) como copolimero de ciclopenteno-polietileno, copolimero de ciclohexano-polietileno, copolimero de ciclohepteno-polietileno, asi como polimeros de cicloolefina (COP) o similares, pentoxido de ditantalio, vidrio, metal o combinaciones de los mismos.

19. Uso de un soporte segun una de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque el sustrato esta configurado como membrana.

20. Uso de un soporte segun una de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque los modulos individuales de al menos una especie de monomero se seleccionan de un grupo que comprende aminas, amidas, dialquiloxietano, presentando la especie de monomero restos de un grupo que comprende H, alquilo o arilo.

21. Uso del soporte segun una de las reivindicaciones 15 a 20 para sistemas de matrices.

22. Uso del soporte segun una de las reivindicaciones 15 a 21 para componentes microfluidicos.