Un procedimiento para amplificar una molécula de ácido nucleico,

dicho procedimiento que comprende (a) mezclar un molde de ARN con una composición que comprende una transcriptasa inversa del virus de leucemia murina de Moloney (M-MLV), una o más ADN polimerasas y una o más moléculas que contienen acetato para proporcionar el ion acetato a una concentración de aproximadamente 60 mM, para formar una mezcla; y (b) incubar dicha mezcla en condiciones suficientes para amplificar una molécula de ADN complementaria al total o una porción de dicho molde de ARN

Composiciones y métodos para la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR).

Campo de la invención

La presente invención está en los campos de la biología molecular y celular.

La invención se refiere particularmente a composiciones y procedimientos útiles para la amplificación de las moléculas de ácido nucleico por la reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR). Específicamente, la invención proporciona composiciones y procedimientos para la amplificación de las moléculas de ácido nucleico en un procedimiento RT-PCR simplificado de una o dos etapas mediante el uso de combinaciones de enzimas transcriptasa inversa y ADN polimerasa termoestable en conjunto con moléculas que contienen acetato (o combinaciones de moléculas que contienen azufre y moléculas que contienen acetato) y opcionalmente albúmina sérica bovina. La invención de este modo facilita la amplificación rápida y eficiente de las moléculas de ácido nucleico y la detección y cuantificación de las moléculas de ARN. La invención también es útil en la producción y amplificación rápida de los ADNc (cadena simple y cadena doble) que se pueden usar para una variedad de propósitos industriales, médicos y forenses.

Antecedentes de la invención

Transcripción inversa de ARN

El término "transcriptasa inversa" describe una clase de polimerasas caracterizada como ADN polimerasas dependiente de ARN. Todas las transcriptasas inversas conocidas requieren un cebador para sintetizar un transcripto de ADN desde un molde de ARN. Históricamente, la transcriptasa inversa se ha usado principalmente para transcribir ARNm en ADNc que posteriormente se puede clonar en un vector para la manipulación adicional.

La transcriptasa inversa del virus de la mioblastosis aviar (AMV) fue la primera ADN polimerasa dependiente de ARN ampliamente usada (Verma, Biochim. Biophys. Acta 473:1 (1977)). La enzima tiene actividad de ADN polimerasa dirigida al ARN 5'-3', actividad de ADN polimerasa dirigida a ADN 5'-3' y actividad de ARNasa H. ARNasa H es una ribonucleasa procesiva 5' y 3' específica para la cadena de ARN para los híbridos ARN-ADN (Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons (1984)). Los errores de transcripción no se pueden corregir con la transcriptasa inversa porque las transcriptasas inversas virales conocidas carecen de actividad de exonucleasa 3'-5' necesaria para la corrección (Saunders y Saunders, Microbial Genetics Applied to Biotechnology, London: Croom Helm (1987)). Un estudio detallado de la actividad de la transcriptasa inversa de AMV y su actividad de ARNasa H asociada ha sido presentada por Berger et al., Biochemistry 22:2365-2372 (1983).

Otra transcriptasa inversa que se usa intensamente en la biología molecular es la transcriptasa inversa originada del virus de leucemia murina Moloney (M-MLV). Ver, por ejemplo, Gerard, G.R., ADN 5:271-279 (1986) y Kotewicz, M.L., et al., Gene 35:249-258 (1985). También se ha descripto la transcriptasa inversa de M-MLV que carece sustancialmente de actividad de ARNasa H. Ver, por ejemplo, Patente U.S. Núm. 5,244,797.

Amplificación por PCR del ARN

Las transcriptasas inversas se han usado extensamente en la transcripción inversa del ARN antes de la amplificación por PCR. Este procedimiento, a menudo denominado como ARN-PCR o RT-PCR, es ampliamente usado para la detección y cuantificación del ARN.

Para tratar de resolver los problemas técnicos a menudo asociados con la RT-PCR, se han desarrollado numerosos protocolos que toman en cuenta las tres etapas básicas del procedimiento: (a) la desnaturalización del ARN y la hibridación del cebador inverso, (b) la síntesis de ADNc; y (c) amplificación por PCR. En el llamado procedimiento RT-PCR "no acoplado" (por ejemplo, RT-PCR de dos etapas), la transcripción inversa se realiza como una etapa independiente mediante el uso de la condición de buffer óptima para la actividad de transcriptasa inversa. Después de la síntesis de ADNc, la reacción se diluye para disminuir el MgCl₂ y las concentraciones de trifosfato de desoxirribonucleósido (dNTP) para las condiciones óptimas para la actividad de ADN polimerasa Taq, y se lleva a cabo una PCR de acuerdo con condiciones estándares (ver Patentes U.S. Núm. 4.683.195 y 4.683,202). Por contraste, los procedimientos RT-PCR "acoplados" usan un buffer común o comprometido para las actividades de transcriptasa inversa y ADN polimerasa Taq. En una versión, el apareamiento del cebador inverso es una etapa separada precedente a la adición de enzimas, que posteriormente se añade al recipiente de reacción único. En otra versión, la actividad de transcriptasa inversa es un componente de la ADN polimerasa Taq termoestable. El apareamiento y la síntesis del ADNc se realizan en presencia de Mn⁺⁺, posteriormente se realiza la PCR en presencia de Mg⁺⁺ después de la eliminación del Mn⁺⁺ por un agente quelante. Finalmente, el procedimiento "continuo" (por ejemplo, RT-PCR de una etapa) integra las tres etapas de RT-PCR en una reacción continua única que evita la apertura del tubo de reacción para la adición del componente o enzima. Se ha descripto la RT-PCR continua como un sistema de enzima único mediante el uso de la actividad de transcriptasa inversa de ADN polimerasa Taq termoestable y polimerasa Tth y como un sistema de dos enzimas mediante el uso de ADN polimerasa AMV-RT y Taq en el que se omitió la etapa de desnaturalización del ARN inicial de 65ºC.

Los intentos para hacer más eficiente el proceso de RT-PCR no han sido fáciles y varios informes han documentado una interferencia entre la transcriptasa inversa y ADN polimerasa Taq termoestable cuando se usan en combinación en una RT-PCR de tubo único por baja sensibilidad o falta de resultados. Por ejemplo, ha habido al menos un informe de una inhibición general de la ADN polimerasa Taq cuando se mezcla con las transcriptasas inversas en mezclas de RT-PCR de una etapa/un tubo (Sellner, L.N., et al., Nucl. Acids Res. 20(7):1487-1490 (1992)). Este mismo informe indicó que la inhibición no se limitó a un tipo de RT: tanto AMV-RT como M-MLV-RT inhibieron la ADN polimerasa Taq y limitaron la sensibilidad de la RT-PCR. En las condiciones de reacción usadas en los estudios de Sellner et al. (67 mM de Tris-HCl, pH 8,8, 17 mM de (NH₄)₂SO₄, 1 mM de β-mercaptoetanol, 6 μM de EDTA, 0,2 mg/ml de gelatina), se halló que el grado de inhibición de Taq polimerasa aumenta con la concentración creciente de RT, hasta una relación de aproximadamente 3 unidades de RT:2 unidades de ADN polimerasa Taq más allá de que Taq polimerasa se volvió completamente inactiva.

Otros informes describen intentos de desarrollar condiciones para las reacciones de RT-PCR de una etapa. Por ejemplo, se ha informado el uso de AMV-RT para la RT-PCR de una etapa en buffer que comprende 10 mM de Tris-HCl, (pH 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl₂, y 0,01% de gelatina (Aatsinki, J.T., et al., BioTechniques 16(2):282-288 (1994)), mientras que otro informe demostró la RT-PCR de una etapa mediante el uso de una composición que comprende ADN polimerasa AMV-RT y Taq en un buffer que consiste en 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM de KCl, 0,01% de gelatina y 1,5 mM de MgCl₂ (Mallet, F., et al., BioTechniques 18(4):678-687 (1995)). En las condiciones de reacción usadas en este último informe, la sustitución de M-MLV-RT (formas de ARNasa H+ o ARNasa H+) para AMV-RT mostró la misma actividad que en la reacción RT-PCR continua.

Breve compendio de la invención

La presente invención se refiere generalmente a las composiciones y procedimientos útiles para la RT-PCR una etapa/un tubo, mediante el uso de M-MLV-RT, o sus derivados ARNasa deficiente en H ("ARNasa H+"), en combinación con una o más ADN polimerasas, en presencia de moléculas que contienen acetato (o combinaciones de moléculas que contienen azufre y moléculas que contienen acetato) para aliviar la inhibición de PCR observada a menudo cuando se usan composiciones que comprenden dos o más enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa, en la que la molécula que contiene acetato proporciona el ion acetato en una concentración de aproximadamente 60 mM.

En particular, la invención se refiere a los procedimientos para amplificar una molécula de ácido nucleico que comprende (a) mezclar un molde de ARN con una composición que comprende una transcriptasa...

1. Un procedimiento para amplificar una molécula de ácido nucleico, dicho procedimiento que comprende

(a) mezclar un molde de ARN con una composición que comprende una transcriptasa inversa del virus de leucemia murina de Moloney (M-MLV), una o más ADN polimerasas y una o más moléculas que contienen acetato para proporcionar el ion acetato a una concentración de aproximadamente 60 mM, para formar una mezcla; y

(b) incubar dicha mezcla en condiciones suficientes para amplificar una molécula de ADN complementaria al total o una porción de dicho molde de ARN.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la ADN polimerasa es Taq ADN polimerasa.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las ADN polimerasas comprende un primer ADN polimerasa que tiene actividad 3' exonucleasa y una segunda ADN polimerasa que tiene actividad de exonucleasa 3' sustancialmente reducida.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la relación de unidades de la transcriptasa inversa a las ADN polimerasas es de aproximadamente 0,2:2 a aproximadamente 500:2.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la relación es de aproximadamente 0,5:2 a aproximadamente 250:2.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la relación es mayor que 3:2.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición además comprende azufre en forma iónica.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el azufre en forma iónica está en una concentración de al menos 18 mM.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 o reivindicación 8, en el que el azufre en forma iónica está en una concentración de al menos 19 mM.

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la concentración de azufre iónico es aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM.

11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la fuente del azufre iónico es un buffer que contiene azufre.

12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la fuente del azufre iónico es una sal que contiene azufre.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el buffer que contiene azufre es TRIS-sulfato (tris[{hidroximetil}]aminometano]sulfato).

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la sal que contiene azufre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de amonio, sulfato de magnesio y sulfato de manganeso.

15. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula que contiene acetato es una sal que contiene acetato.

16. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula que contiene acetato es un buffer que contiene acetato.

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la sal que contiene acetato se selecciona del grupo que consiste en acetato de amonio, acetato de magnesio, acetato de manganeso, acetato de sodio y acetato de potasio.

18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el buffer que contiene acetato se selecciona del grupo que consiste en TRIS-acetato (Tris[(hidroximetil)laminometano]acetato), ADA (ácido N-[2-acetamido]-2iminodiacético), y acetato de imidazol (ácido 2-hidroxi-3-[4-imidazolil]-propiónico).

19. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la mezcla además comprende uno o más nucleótidos.

20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que los nucleótidos son trifosfatos de desoxirribonucleósido o sus derivados, o ditrifosfatos de desoxirribonucleósido o sus derivados.

21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que los trifosfatos de desoxirribonucleósido se seleccionan del grupo que consisten en dATP, dUTP, dTTP, dGTP, y dCTP.

22. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la mezcla además comprende uno o más cebadores de oligonucleótidos.

23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el cebador es un cebador oligo(dT).

24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el cebador es un cebador específico del blanco.

25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el cebador es un cebador específico del gen.

26. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la transcriptasa inversa está sustancialmente reducida en cuanto a la actividad de ARNasa H.

27. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las ADN polimerasas son ADN polimerasas termoestables.

28. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, en el que las ADN polimerasas termoestables se seleccionan del grupo que consiste en Tne, Tma, Taq, Pfu, Tth, Tfi, VENT, DEEPVENT, Pwo, Tfl, y sus mutantes, variantes y derivados.

29. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha ADN polimerasa que tiene actividad de 3' exonucleasa se selecciona del grupo que consiste en Pfu, Pwo, DEEPVENT, VENT, Tne, Tma, Kod, y sus mutantes, variantes y derivados.

30. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha ADN polimerasa que tiene actividad de 3' exonucleasa sustancialmente reducida se selecciona del grupo que consiste en Taq, Tfl, Tth, y sus mutantes, variantes y derivados.

31. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de incubación (b) comprende

(a) incubar la mezcla a una temperatura y durante un tiempo suficiente para obtener una molécula de ADN complementario con el total o una porción de dicho molde de ARN; e

(b) incubar la molécula de ADN complementario con el molde de ARN a una temperatura y durante un tiempo suficiente para amplificar la molécula de ADN.

32. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, en el que la primera etapa comprende incubar dicha mezcla a una temperatura de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 60ºC.

33. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, en el que la segunda etapa comprende termociclado.

34. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 32, en el que el termociclado comprende alternar el calentamiento y el enfriamiento de la mezcla suficiente para amplificar la molécula de ADN.

35. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 34, en el que el termociclado comprende alternar desde un primer intervalo de temperatura de aproximadamente 90ºC a aproximadamente 100ºC, a un segundo intervalo de temperatura de aproximadamente 45ºC a aproximadamente 75ºC.

36. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 35, en el que el segundo intervalo de temperatura es de aproximadamente 65ºC a aproximadamente 75ºC.

37. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en el que dicho termociclado se realiza más de 10 veces.

38. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en el que el termociclado se más realiza más de 20 veces.

39. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la transcriptasa inversa es SuperScript I o SuperScript II.

40. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición además comprende una o más moléculas que contienen potasio.

41. Una composición que comprende una transcriptasa inversa de virus de leucemia murina de Moloney (M-MLV), una o más ADN polimerasas, y una o más moléculas que contienen acetato para proporcionar el ion acetato a una concentración de aproximadamente 60 mM.

42. Una composición de acuerdo con la reivindicación 41, que además comprende una o más moléculas que contienen azufre que proporcionan azufre en forma iónica.

43. Una composición de acuerdo con la reivindicación 42, en el que el azufre iónico está en una concentración de al menos 18 mM.

44. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43 que además comprende una o más moléculas que contienen potasio.