Fast PCR para la genotipificación de STR.

Un método que comprende: someter una mezcla de reacción a al menos un ciclo de amplificación,

en donde la mezcla de reacción comprende un ácido nucleico de doble hebra,

al menos 15 pares de cebadores en donde cada par de cebadores es susceptible de recocido con un locus de repetición corta en tándem (STR),

en donde el ciclo de amplificación es una amplificación de dos etapas en donde la extensión se produce a una temperatura de recocido en donde la temperatura de recocido oscila de aproximadamente 55°C a aproximadamente 75°C, y

detectar de ese modo un perfil de STR completo.

Fast PCR para la genotipificación de STR CAMPO

En general, las presentes ilustraciones se refieren a la amplificación de una muestra de ácido nucleico con el fin de obtener un perfil de STR en menos de 45 minutos.

Antecedentes

Puesto que el proceso de PCR depende enormemente del funcionamiento de la ADN polimerasa utilizada, se han investigado diversas ADN polimerasas naturales o rediseñadas in vitro. Dos propiedades clave de una ADN polimerasa juegan papeles importantes en la determinación del tiempo de reacción global requerido para la amplificación por PCR. La primera propiedad es la "tasa de elongación" (o "tasa de extensión"), que se define como el número de nucleótidos polimerizados por segundo por molécula de ADN polimerasa. La segunda propiedad es la "procesividad", que se define como el número medio de nucleótidos añadidos por una ADN polimerasa en un único evento de unión. Tanto la "tasa de elongación" como la "procesividad" dependen de los componentes del medio de reacción y de la secuencia del molde de ADN.

Una detección rápida y exacta de los perfiles de ADN es un aspecto clave del análisis de muestras forenses y la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) juega una parte integral en este proceso. Los métodos para disminuir el tiempo de PCR ahorrarán trabajo al técnico. Hay una necesidad no satisfecha para disminuir el tiempo de PCR sin comprometer la sensibilidad, la especificidad y la exactitud de los resultados.

Vallone et al. (Forensic Science International, vol 3, núm. 1 28) describen un protocolo de PCR de ciclo rápido que amplifica 15 loci STR utilizando una polimerasa distinta de la ADN polimerasa AmpliTaqGoId convencional. Giese et al. (Journal of Forensic Science, vol 54, núm. 6 29) describen una PCR múltiple rápida para la amplificación de STR. El documento W26/74233 describe una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a ácido nucleico y una polimerasa para mejorar la PCR. Yoshida et al. (Fisheries Science, vol 66, 2 págs. 397-399) describen la mejora de la PCR para detectar dinucleótidos polimorfos. Esta reacción no es una reacción múltiple. Butler et al. (Forensic Science International, vol. 129, 22 págs. 1-24) describen una reacción de PCR múltiple. La Figura 1 muestra el método utilizado en la aparición de diversos amplicones espúreos con tamaños similares al del amplicón esperado.

Compendio de algunas realizaciones de la invención

La presente invención proporciona un método para amplificar una secuencia de ácido nucleico en donde el método implica someter una mezcla de reacción a al menos un ciclo de amplificación, en donde la mezcla de reacción comprende un ácido nucleico de doble hebra, al menos 15 pares de cebadores en donde cada par de cebadores es susceptible de recocido con un locus de una repetición corta en tándem (STR) diferente, en donde el ciclo de amplificación es una amplificación en dos etapas en donde la extensión se produce a una temperatura de recocido en donde la temperatura de recocido oscila de aproximadamente 55°C a aproximadamente 75°C, y por medio de lo cual se detecta un perfil de STR completo.

Preferiblemente, el tiempo para completar un ciclo de amplificación es de 25 segundos.

En algunas realizaciones la temperatura de recocido en el ciclo de amplificación es al menos aproximadamente 5°C mayor, 1°C mayor, o 15°C mayor que la Tm pronosticada de al menos dos de los cebadores mientras la temperatura de recocido oscila de aproximadamente 55°C a aproximadamente 75°C y el recocido y la extensión se producen a la misma temperatura. En algunas realizaciones la mezcla de reacción se mantiene a la temperatura de recocido durante 1 segundo, 2 segundos, 3 segundos o hasta 2 segundos o más. En algunas realizaciones la temperatura de desnaturalización es de 4 a 8 segundos y la temperatura de recocido junto con la temperatura de extensión es de 5 segundos a 25 segundos.

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa utilizada en el protocolo Fast PCR en la presente memoria es una ADN polimerasa de la Familia A (Pol A) de cualquier fuente natural o recombinante incluyendo fragmentos y variantes de los mismos.

En algunas realizaciones, el método del protocolo Fast PCR ilustrado en la presente memoria se puede utilizar para la amplificación de una muestra de ácido nucleico para obtener un perfil de STR en 45 minutos o menos. En otras realizaciones se amplifican un múltiplex de al menos 15 loci STR, al menos 2 loci STR o al menos 4 loci STR más los loci de amelogenina mediante el método del protocolo Fast. En algunas realizaciones, el método del protocolo Fast PCR se utiliza para una reacción de PCR en tiempo real.

Se describen kits con configuraciones variables para su uso en la identificación de seres humanos que comprenden al menos un par de cebadores para la amplificación de loci de STR en un ciclo de amplificación de 25 segundos o menos.

Breve descripción de los dibujos

Las FIGURAS 1A-1E son esquemas que representan los resultados en la réplica de un experimento de titulación de enzima utilizando Platinum® Taq y el protocolo Fast PCR.

Descripción de las realizaciones ilustrativas

Con el propósito de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y cuando sea apropiado, los términos utilizados en singular también incluirán el plural y viceversa. En caso de que cualquier definición siguiente entre en conflicto con el uso de esa palabra en cualquier otro documento, la definición mostrada más abajo siempre prevalecerá con el fin de interpretar esta memoria descriptiva y sus reivindicaciones asociadas a menos que se pretenda claramente un significado contrario (por ejemplo en el documento en el que se utiliza originalmente el término). Se observa que, según se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el" y "la", incluyan los referentes en plural a menos que expresamente e inequívocamente se limiten a un referente. El uso de "o" representa "y/o" a menos que se establezca de otro modo. Con fines ilustrativos, pero no como limitación, "X y/o Y" pueden significar "X" o "Y" o "X e Y". El uso de "comprenden", "comprende", "que comprende", "incluyen", "incluye", y "que incluye" son indistintos y no se pretende que sea limitante. Además, cuando la descripción de una o más realizaciones utiliza el término "que comprende", los expertos en la técnica comprenderán que, en algunos casos específicos, la realización o las realizaciones se pueden describir alternativamente utilizando la expresión "que consiste esencialmente en" y/o "que consiste en". El término "y/o" representa uno o todos los elementos enumerados o una combinación de dos o más de los elementos enumerados.

Los encabezamientos de sección utilizados en la presente memoria tienen fines meramente organizativos y no se deben considerar limitantes de la materia sujeto descrita en modo alguno. La práctica de la presente invención puede emplear técnicas convencionales y descripciones de la química orgánica, tecnología de polímeros, biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), biología celular, bioquímica, e inmunología, que están dentro del conocimiento práctico de la técnica. Tales técnicas convencionales incluyen síntesis de oligonucleótidos, hibridación, reacción de extensión, y detección de hibridación utilizando una marca. Las ilustraciones específicas de las técnicas adecuadas se pueden obtener mediante la referencia al ejemplo descrito en la presente memoria más abajo. No obstante, también se pueden utilizar, por supuesto, otros procedimientos convencionales equivalentes. Tales técnicas convencionales y descripciones se pueden encontrar en manuales de laboratorio convencionales tales como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vol. I-IV), PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todos de Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, Londres, Nelson y Cox (2), Lehninger, Principies of Biochemistry 3a Ed., W. H. Freeman Pub., Nueva York, N.Y. y Berg et al. (22) Biochemistry, 5a Ed., W. H. Freeman Pub., Nueva York, N.Y.

Según se utiliza en la presente memoria, "amplificar" hace referencia al proceso de incrementar enzimáticamente la cantidad de una secuencia de nucleótidos específica. Esta amplificación no está limitada a, pero generalmente se logra mediante PCR. Según se utiliza en la presente memoria, "desnaturalización" hace referencia a la separación de dos hebras de nucleótidos complementarias a partir de un estado recocido. La desnaturalización puede ser inducida por numerosos factores, tales... [Seguir leyendo]

1. Un método que comprende: someter una mezcla de reacción a al menos un ciclo de amplificación, en donde la mezcla de reacción comprende un ácido nucleico de doble hebra,

al menos 15 pares de cebadores en donde cada par de cebadores es susceptible de recocido con un locus de repetición corta en tándem (STR),

en donde el ciclo de amplificación es una amplificación de dos etapas en donde la extensión se produce a una temperatura de recocido en donde la temperatura de recocido oscila de aproximadamente 55°C a aproximadamente 75°C, y

detectar de ese modo un perfil de STR completo

2. El método de la reivindicación 1, en donde el tiempo hasta completar un ciclo de amplificación es de 25 segundos.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la temperatura de recocido es al menos aproximadamente 5°C, o al menos aproximadamente 1°C, o al menos aproximadamente 15°C mayor que la Tm pronosticada de al menos uno de los cebadores.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la temperatura de recocido es de aproximadamente 57°C a aproximadamente 72°C.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la mezcla de amplificación comprende una ADN polimerasa Taq o un fragmento o variante de ADN polimerasa Taq que tiene actividad polimerasa.

6. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente al menos un par de cebadores susceptible de recocido con hebras complementarias del ácido nucleico de doble hebra y amplificación de una región del locus de amelogenina, preferiblemente en donde dicho locus de amelogenina amplificado se encuentra en el cromosoma X y en el cromosoma Y.

7. El método de la reivindicación 1, en donde la mezcla de reacción se somete hasta a 25, hasta a 3 o hasta a 4 ciclos de amplificación.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el número de moléculas amplificadas producidas en al menos uno de los uno o más ciclos de amplificación es de 1,6 veces a 2 veces el número de moléculas presente al inicio del al menos un ciclo de amplificación.

9. El método de la reivindicación 1, en donde la eficacia de la amplificación de la polimerasa del al menos un ciclo de amplificación es de ,8 a 1,.