Cebadores para la detección de especies de Phaeoacremonium, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La invención se refiere a dos cebadores específicos, Pm1 y Pm2, para la .detección de especies de patógenos fúngicos concretamente del Phaeoacremonium de la vid, en suelo, madera y agua potencialmente infectados con dicho patógeno, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o PCR anidada. También comprende un kit de diagnóstico que contiene dichos cebadores

Cebadores para la detección de especies de Phaeoacremonium, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a dos cebadores específicos, Pm1 y Pm2, para la detección de especies de patógenos fúngicos concretamente del Phaeoacremonium de la vid, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); y también a un kit de diagnóstico que contiene dichos cebadores.

Antecedentes de la invención

Las especies del género Phaeoacremonium spp. están asociadas a dos de las enfermedades más destructivas de la vid, la enfermedad de Petri en planta joven y yesca en planta adulta.

Los principales patógenos identificados en la enfermedad de Petri son Phaeoacremonium spp. y Phaeomoniella chlamydospora (clasificado como Phaeoacremonium chlamydosporum hasta el año 2000). Esta enfermedad puede causar pérdidas económicas significativas debido a la necesidad de replantar y la consiguiente pérdida de rendi-miento.

Los síntomas en campo de la enfermedad de Petri se traducen en plantas con crecimiento débil y lento, menor masa foliar, hojas cloróticas y pequeñas, retraso en su desarrollo y muchas veces dejan de brotar y terminan muriendo. Mediante un corte transversal en la madera se puede observar el obscurecimiento de los vasos del xilema.

En los últimos años se ha detectado un importante incremento de incidencia de la enfermedad de Petri en plantas de vid e incluso se ha observado en vides recién plantadas W.A. Stamp: The contribution of imperfections in nursery stock to the decline of young vines in Calfornia. Phytopathologia Mediterranea, (2001) 40: 369-375). Esto obliga a la reposición de las plantas enfermas, originando costes adicionales a las nuevas plantaciones, además de un crecimiento desigual.

La mayoría de las plantas que se utilizan en nuevas plantaciones son plantas injertadas que se obtienen por un proceso de producción en viveros que dura un año y medio. Este proceso comienza cortando los brotes de plantas "madre" para producir varetas de aproximadamente 40 cm. Y que son almacenadas en cámaras frías hasta su uso. Estas varetas se rehidratan en un baño de agua durante una semana , aproximadamente antes de ser injertadas. Las plantas injertadas se producen injertando una yema de la variedad de vid (Ej. Tempranillo, Cabernet Sauvignon...) sobre una vareta de portainjertos de vid (Ej: R-110, 140Rn...). Una vez realizado el injerto, se sella con parafina, se almacenan en un lecho de turba para favorecer el enraizamiento y se guardan durante 20 días en una cámara de encallecimiento. Después se plantan en el terreno para la producción de raíces, donde permanecen a lo largo de una estación vegetativa hasta la siguiente parada invernal.

Hay estudios que han demostrado que las plantas procedentes de viveros están infectadas con patógenos de enfermedades de la madera, entre ellos con el hongo Phaeoacremonium spp. (A. Aroca y R. Raposo: Hongos patógenos detectados en plantas de vivero de vid. Phytoma España (2005) p.167; A. Aroca, F. Garcia-Figueras, I. Bracamonte, J. Luque y R. Raposo. European Journal of Plant Pathology (2006) 115: 195-202; A. Jiménez-Jaime, A. Aroca, R. Raposo, J. garcia-Jimenez y J. Armengol: Ocurrence of Fungal Pathogens Associated with Grapevine Nurseries and the Decline of Young Vines in Spain. Journal of Phytopathology (2006) 154(10): 598-602) en muchos lugares, incluida España, y en muchos casos el material vegetal procedente de plantas madres utilizado para la producción de nuevas plantas también está infectado por estos patógenos (G. Surico: Towards commonly agreed answers to some basic questions on esca. Phytopathologia Mediterranea (Suplement) (2001) 40: 369-375; S.A. Whiteman, M.V. Jaspers, A. Stewart, H.J. Ridgway: Identification of potential sources of Phaeomoniella chlamydospora in the grapevine propagation process. Phytopathologia Mediterranea (2003) 43:152-153). Esto constituye un inóculo en las nuevas plantaciones al introducir plantas infectadas en el terreno, a la vez que una fuente potencial de infección durante el proceso de propagación de planta en los viveros, ya que al introducir material vegetal infectado en el proceso de producción podrá infectar varetas anteriormente sanas.

Por todo lo anterior es muy importante el poder detectar Phaeoacremonium spp. de una forma rápida y segura. Una esperanza es que la certificación incluya algún día patógenos fúngicos, además de los virus, pero esto no es realizable a corto plazo.

La detección de Phaeoacremonium spp. en vid mediante métodos tradicionales de aislamiento en medio de cultivo es lenta y tediosa, ya que son hongos de crecimiento lento que tardan aproximadamente 15 días en producir una colonia de 2 cm de diámetro y que pueden ser fácilmente enmascarados por otros hongos de crecimiento más rápido presentes en vid. La identificación de este género mediante caracteres morfológicos es difícil y ha llevado a continuos errores de clasificación ya que las claves de identificación están basadas en la descripción de la colonia (forma y color) y en caracteres morfológicos como el tamaño de las esporas, tipo de conidióforo y tamaño y tipo de la célula conidiógena (fiálida).

El diagnóstico debe efectuarse mediante el aislamiento de los hongos implicados y debe realizarse en un laboratorio de fitopatología, pues diversos factores fisiológicos u otros patógenos pueden causar síntomas parecidos.

Por lo tanto, es necesaria una técnica basada en métodos moleculares para facilitar y agilizar la detección y asegurar una correcta identificación del género.

Para conseguir satisfacer esta necesidad, el objeto de la presente invención son unos cebadores específicos para el género Phaeoacremonium, es decir que reconocen todas las especies de Phaeoacremonium presentes en vid y que pueden ser utilizados en una única reacción de PCR para detectar cualquiera de las especies de Phaeoacremonium.

En la bibliografía, existe un artículo (M. Groenewald, D.U. Bellstedt and P.W. Crous: A PCR-based method for the detection of Phaeomoniella chlamydospora in grapevines. South African Journal of Science, (2000), 96(1): 42-46) que se centra en el diseño de cebadores específicos (PCL1 y PCL2) para la detección de Phaeomoniella chlamydospora en vides que no necesitan mostrar síntomas de estar infectadas. Estos cebadores tienen homología con la región ITS1 e ITS2 del rDNA respectivamente. La amplificación por PCR con PCL1 y PCL2 da lugar a un fragmento de 325 bp que corresponde a Phaeomoniella chlamydospora. La amplificación puede tener lugar con cantidades de DNA fúngico desde 16 pg. Tras realizar la amplificación por PCR de la región de rDNA de muestras de Phaeoacremonium spp. y Phaeomoniella chlamydospora con los cebadores ITS1 e ITS4, los autores del artículo proceden a su secuenciación. Tras la alineación de las secuencias, observan que las regiones correspondientes a ITS1 e ITS2 de Phaeomoniella chlamydospora varían con respecto al resto de especies identificadas; así diseñan dos cebadores específicos de especie correspondientes a las bases 160-180 de ITS1 y 465-485 de ITS2 de Phaeomoniella chlamydospora. Los investigadores prueban los cebadores con muestras de hongos de distintas especies. Solo se observa amplificación positiva al usar los cebadores PCL1 y PCL2 cuando en la muestra está presente Phaeomoniella chlamydospora, demostrando su especificidad (ya que no se observan productos de amplificación de DNA genómico de otros taxones testados). Así, se con- cluye que la prueba diagnóstica por PCR permite una rápida identificación de Phaeomoniella chlamydospora en vid.

También se conoce un artículo (S.A. Whiteman, M.V. Jaspers, A. Stewart and H.J. Ridgway: Detection of Phaeomoniella chlamydospora in soil using species-specific PCR. New Zealand Plant Protection, (2002) 55:139-145) en el que se describe que, tras la extracción de DNA de Phaeomoniella chlamydospora (presente en suelo infectado como fuente de inóculo), se evalúa la capacidad de cebadores específicos para detectar Phaeomoniella chlamydospora en suelos de vid. Usando ensayos de PCR anidada, los investigadores llevan a cabo un proceso en el que se realiza una preamplificación de una región de 600 pares de bases de DNA ribosómico. En primer lugar se usan los cebadores universales ITS4 y NS1 y posteriormente se realiza una amplificación del DNA obtenido con ITS2 e ITS5 para comprobar que...

1. Cebadores oligonucleótidicos para la detección de especies del género Phaeoacremonium, caracterizados porque comprenden las secuencias denominadas Pm1 y Pm2 siguientes:

2. Método para la detección de especies del género Phaeoacremonium en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

3. Método para la detección de especies del género Phaeoacremonium en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

4. Método para la detección de especies del género Phaeoacremonium en una muestra, de acuerdo con las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque el ADN de la muestra para la detección de Phaeoacremonium spp. se ha extraído de micelio de hongo.

5. Método para la detección de especies del género Phaeoacremonium en una muestra, de acuerdo con las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque el ADN de la muestra para la detección de Phaeoacremonium spp. se ha extraído de madera sospechosa de estar infectada con dicho patógeno.

6. Método para la detección de especies del género Phaeoacremonium en una muestra, de acuerdo con las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque el ADN de la muestra para la detección de Phaeoacremonium spp. se ha extraído de suelo sospechoso de estar infectado con dicho patógeno.

7. Método para la detección de especies del género Phaeoacremonium en una muestra, de acuerdo con las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque el ADN de la muestra para la detección de Phaeoacremonium spp. se ha extraído de agua sospechosa de estar infectada con dicho patógeno.

8. Un kit para la detección de especies del género Phaeoacremonium en una muestra de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-7, que comprende los cebadores Pm1 (Seq. ID. No. 1) y Pm2 (Seq. ID. No. 2) de las reivindicación 1, capaces de amplificar ADN de Phaeoacremonium spp. mediante la reacción PCR y PCR anidada; y además todos los reactivos necesarios para realizar la PCR.

9. Un kit para la detección de especies del género Phaeoacremonium en una muestra de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que comprende los cebadores Pm1 (Seq. ID. No. 1) y Pm2 (Seq. ID. No.) de la reivindicación 1, capaces de amplificar ADN de Phaeoacremonium spp. mediante la reacción PCR y PCR anidada; y además todos los reactivos necesarios para realizar la PCR anidada.