Un proceso para detectar contaminación por microorganismos en una muestra líquida seleccionada de agua,

productos alimenticios y fármacos y la enumeración e identificación de cualquiera de tales microorganismos que comprende las etapas secuenciales de:

a) filtrar la muestra líquida a través de una membrana adecuada para la retención de microorganismos para retener los microorganismos de dicha muestra en dicha membrana;

b) incubar la membrana desde alrededor de 1 hora hasta alrededor de 8 horas para el enriquecimiento de los microorganismos;

d) detectar la presencia/ausencia de uno o más microorganismos en la membrana, el número y tipo de los mismos detectados, caracterizados por, entre las etapas (b) y (d) la etapa de

c) someter la membrana a una etapa de amplificación en el que la etapa de amplificación contiene uno o más agentes de detección, en el que la etapa de amplificación es seleccionada a partir del grupo que consiste en la reacción polimerasa en cadena (PCR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) y amplificación lineal ligada (LLA)

Proceso para la enumeración identificación de microorganismos.

El presente invento se refiere a un proceso para enumerar e identificar microorganismos. Más particular-mente, se refiere a un proceso para amplificar componentes específicos de los microbios presentes y después enumerarlos en un dispositivo de membrana en una etapa única con un tiempo de incubación mínimo o nulo basado en la detección del producto componente amplificado. Adicionalmente, los microbios presentes pueden ser identificados mediante este método.

Antecedentes del invento

El método tradicional para determinar la presencia o ausencia de microorganismos en líquidos tales como agua, productos alimenticios tales como zumos o fármacos ha sido el de filtrar el fluido a través de una membrana adecuada para atrapar cualquier microorganismo presente en el fluido de la superficie de la membrana. La membrana es entonces colocada en una placa con medio de crecimiento tal como una placa Petri rellena con agar u otro medio adecuado y luego incubada durante varios días para permitir a las colonias desarrollarse a partir de los organismos capturados.

Las placas son entonces retiradas y examinadas visualmente de modo que el número de colonias presentes puede ser contada. Si el número es suficientemente elevado, ensayos adicionales pueden ser llevados a cabo para determinar exactamente qué organismos están presentes. (Con frecuencia la mera presencia de organismos no es en sí misma una indicación de que el fluido es insalubre y se requiere un trabajo adicional para identificar los organismos específicos).

Este proceso puede extenderse típicamente de dos a catorce días o más dependiendo de los organismos, su tiempo de incubación prescrito y la tasa de crecimiento y los ensayos de identificación adicionales que necesitan ser corridos así como de cuando una muestra es tomada durante un día hábil y cuando estará lista en el siguiente día hábil.

Recientemente, nuevos ensayos para la detección y enumeración de contaminantes microbianos han ayudado a reducir el tiempo requerido para lleva a cabo ensayos hasta alrededor de 24 horas y a veces menos. Por ejemplo, la bioluminiscencia de ATP es una reacción bioquímica que produce energía luminosa como producto; este método ha sido usado para detectar y enumerar microbios en 1/3 del tiempo de crecimiento necesario para la detección visual en el medio. Otras tecnologías utilizan moléculas fluorescentes, u otras tinciones para detectar rápidamente microorganismos de una variedad de muestras en membranas. La tecnología de hibridación de sondas ha sido también usada para detectar y enumerar microorganismos en membranas en ventanas de tiempo más cortas que el crecimiento en colonias; en estos casos, los microbios que han sido hechos crecer en una membrana durante un corto período de tiempo son hibridados con sondas de ácidos nucleicos y tratados con un reactivo de detección para detectar cualquier microcolonia presente en la superficie de las membranas.

El documento de patente norteamericana 2003-0003540-A1 mejora los ensayos de ATP. Este captura microbios en una membrana e incuba los organismos en medio durante varias horas hasta un día. Primero se lleva a cabo un ensayo de enumeración (generalmente una detección de ATP bioluminiscente) y luego las sondas PNA son usadas en un segundo ensayo en la misma muestra para determinar la identificación de los microbios encontrados.

Ninguno de estos ensayos sin embargo permite tener un ensayo que detecte, enumere e identifique los microorganismos a tiempo real (en un intervalo de pocas horas) con la misma precisión y especificidad del ensayo visual multidía clásico. El presente invento proporciona un ensayo único que detecta y enumera el microorganismo en cuestión de unas pocas horas en una membrana celular, y también permite la identificación en el mismo procedimiento.

Los autores son conscientes de la publicación de patente internacional WO 99/60005 (FSM Technologies Limited) que describe métodos y un dispositivo de filtro para purificar los ácidos nucleicos a partir de células completas en una muestra de sangre completa. La filtración de fluidos entrecruzados es usada para romper las membranas celulares y nucleares a través de la cual la muestra es hecha pasar a través de la superficie de una membrana porosa en un dispositivo de filtro, la ruta desde la entrada hasta la salida del dispositivo está parcialmente bloqueada permitiendo que el flujo de restos celulares por la membrana no pueda atascar los poros.

La publicación de patente internacional WO 01/59157 (Millipore Corp) describe un ensayo para la detección, enumeración e identificación de microorganismos en una muestra fluida. El ensayo usa un filtro a través del cual una muestra fluida es hecha pasar y sobre el que los organismos en el fluido son depositados. Se incuba entonces sobre un medio de crecimiento y tras lo cual es sometido a un ensayo de presencia-ausencia para organismos usando un ensayo de ATP/bioluminiscencia. La misma muestra y el filtro son entonces sometidos a un ensayo de sonda PNA para organismos diana. Opcionalmente, la localización de los organismos detectados por cada ensayo pueden ser comparadas entre sí para determinar la posibilidad de falsos positivos y su eliminación de los resultados del ensayo.

La publicación de patente internacional WO 03/085109 (Genesystems) se refiere a un método para extraer ácidos nucleicos de microorganismo contenidos en una mezcla compleja, particularmente una mezcla alimenticia, que comprende al menos las siguientes etapas: la mezcla es clarificada; los microorganismos son retenidos en un cartucho filtrante; dichos microorganismos son lisados; y los ácidos nucleicos son recuperados, concentrados, y purificados: También descrito está un cartucho filtrante y un aparato usado para llevar a cabo el método de extracción, y un dispositivo para extraer, detectar, y si fuera necesario cuantificar los ácidos nucleicos de los microorganismo contenidos en una mezcla compleja.

Sumario del invento

Las características esenciales y opcionales del presente invento son expuestas en las reivindicaciones principales y subreivindicaciones acompañantes respectiva-mente. Así el presente invento se refiere a un proceso para la detección, enumeración e identificación de microorganismos en un fluido usando filtración en membrana, amplificación dirigida y detección tales como mediante detección fluorescente o detección colorimétrica. Un atributo clave del presente proceso es que la etapa de amplificación permite la detección rápida, enumeración e identificación de organismos que están presentes. La amplificación se dirige a una molécula seleccionada en el organismo tal como su ADN o ARN y aumenta la presencia de la molécula a un nivel que es detectable por cualquier número de tecnologías de detección disponibles para confirmar que la molécula diana esté presente. El reactivo de amplificación contiene uno o más agentes de detección para indicar la presencia de (una) molécula(s) diana y permite diferenciar entre las dianas seleccionadas a nivel de especie o género o incluso filo, o reino.

En los dibujos

La Figura 1 muestra un diagrama en bloques de una realización preferida del presente invento.

Descripción detallada de la especificación

El presente invento se refiere a un proceso para la detección rápida, enumeración e identificación de microorganismos en fluido o sólidos solubles tales como polvos, sales, cremas, tabletas, etc. Tales fluidos incluyen pero no se limitan a agua, potable o no, lácteos tales como leche, cerveza, vino, refrescos, zumos de frutas, fármacos, parenterales, muestras de aire bacteriano, etc.

La rápida tecnología actual permite detectar y enumerar microorganismos en bastante menos tiempo que los métodos clásicos de crecimiento para colonias visibles en agar o filtros de membrana. Sin embargo, estos organismos detectados permanecen sin identificar. Esta idea se dirige a la necesidad de una detección inmediata y un sistema de enumeración, y permite la identificación posible de los organismos detectados con sondas específicas frente a los grupos de especies o géneros en las reacciones de amplificación, o a niveles superiores con sondas específicas de filos, o clases.

El producto visualizado es una reacción de amplificación dirigida, asociada a membrana tal como, pero que no incluye, el método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) acoplado a una membrana compuesta de los dominios hidrofílicos unidos por rejillas hidrofóbicas tales como los...

1. Un proceso para detectar contaminación por microorganismos en una muestra líquida seleccionada de agua, productos alimenticios y fármacos y la enumeración e identificación de cualquiera de tales microorganismos que comprende las etapas secuenciales de:

a) filtrar la muestra líquida a través de una membrana adecuada para la retención de microorganismos para retener los microorganismos de dicha muestra en dicha membrana;

b) incubar la membrana desde alrededor de 1 hora hasta alrededor de 8 horas para el enriquecimiento de los microorganismos;

d) detectar la presencia/ausencia de uno o más microorganismos en la membrana, el número y tipo de los mismos detectados, caracterizados por, entre las etapas (b) y (d) la etapa de

c) someter la membrana a una etapa de amplificación en el que la etapa de amplificación contiene uno o más agentes de detección, en el que la etapa de amplificación es seleccionada a partir del grupo que consiste en la reacción polimerasa en cadena (PCR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) y amplificación lineal ligada (LLA).

2. El proceso de la reivindicación 1, en el que la muestra líquida es desde 50 a 1000 mililitros.

3. El proceso de la reivindicación 1 ó 2, en el que la membrana es seleccionada a partir del grupo que consiste en membrana de PVDF que tiene áreas hidrofílicas separadas por particiones hidrofóbicas.

4. El proceso de cualquier reivindicación precedente, en el que la etapa de amplificación tiene lugar desde un período de tiempo desde alrededor de 30 a alrededor de 90 minutos.

5. El proceso de cualquier reivindicación precedente, en el que la amplificación es un sistema de amplificación basado en ácidos nucleicos.

6. El proceso de la reivindicación 5, en el que

a) el agente de detección es seleccionado del grupo que consiste en una sonda de ácidos nucleicos marcada fluorescentemente o una sonda de ácidos nucleicos peptídica y mezclas de las mismas y es leída mediante un sistema de imagen digital, o

b) la amplificación es un sistema de amplificación basada en ácidos nucleicos en forma de reacción polimerasa en cadena (PCR) y el agente de detección es seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico marcado fluorescentemente, sonda de ácidos nucleicos peptídica y mezclas de las mismas y es leída mediante un sistema de imagen digital, o

c) el reactivo es seleccionado a partir del grupo que consiste en una diana de ADN y una diana de ARN y el agente de detección es seleccionado a partir del grupo que consiste en un ácido nucleico marcado fluorescentemente, una sonda de ácidos nucleicos peptídica y mezclas de las mismas y es leída mediante un sistema de imagen digital, o

d) la amplificación es un sistema de amplificación basada en ácidos nucleicos en forma de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), siendo el reactivo seleccionado del grupo que consiste en una diana de ADN y una diana de ARN y el agente de detección es seleccionado a partir del grupo que consiste en un ácido nucleico marcado fluorescente-mente, una sonda de ácidos nucleicos peptídica y mezclas de las mismas y es leída mediante un sistema de imagen digital.

7. El proceso de cualquier reivindicación precedente, en el que el agente de detección es leído mediante un proceso seleccionado a partir del grupo que consiste en películas de rayos X, detección visual de una reacción colorimétrica en la membrana, detección visual de una marca fluorescente o mediante imagen digital.

8. El proceso de la reivindicación 1, en el que la membrana es sometida a dicha etapa de amplificación durante un tiempo desde alrededor de 30 minutos hasta alrededor de 90 minutos en un dispositivo controlado por la temperatura, tal como un termociclador.

9. El proceso de la reivindicación 1, en el que la membrana es incubada desde 1 a alrededor de 4 horas.

10. El proceso de la reivindicación 1, en el que el agente de detección es seleccionado de entre una marca fluorescente, una marca radioactiva, una marca colorimétrica y una marca enzimática.