BANCO DE EXPRESIÓN DE PÉPTIDOS IN VITRO.

Un método para producir una genoteca de expresión de péptidos in vitro que comprende una pluralidad de péptidos,

donde cada péptido está unido al constructo de ADN que codifica el péptido, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un constructo de ADN que comprende: (i) una secuencia de ADN diana; (ii) ADN que codifica un péptido miembro de la genoteca; y (iii) ADN que codifica un péptido capaz de unirse no covalentemente directamente o indirectamente a dicha secuencia diana de ADN de (i); donde dichos constructo de ADN y proteína codificada se seleccionan para que tengan actividad cis (b) expresar una pluralidad de constructos de ADN de acuerdo con (a) donde dichos constructos de ADN codifican una pluralidad de péptidos miembros de la genoteca de manera que cada péptido expresado está unido no covalentemente al ADN a partir del cual fue producido

Campo de la Invención

La presente invención se refiere generalmente a la tecnología de ADN recombinante y, más concretamente, a métodos in vitro para construir y escrutar genotecas de ADN en busca de secuencias de ADN que codifican moléculas biológicamente activas. 5

Antecedentes de la Invención

Aislar una gen desconocido que codifica un péptido deseado de una genoteca de ADN recombinante puede ser una tarea difícil. El uso de sondas de hibridación puede facilitar el procedimiento, pero su uso depende generalmente del conocimiento de al menos una porción de la secuencia del gen que codifica la proteína. Cuando la secuencia no se conoce, las genotecas de ADN se pueden expresar en un vector de 10 expresión, y se han utilizado anticuerpos para escrutar placas o colonias en busca del antígeno proteico deseado. Este procedimiento ha sido útil en el escrutinio de genotecas pequeñas, pero se pueden pasar por alto fácilmente secuencias de escasa aparición que están representadas en menos de aproximadamente 1 en 105 clones, como es el caso de las moléculas de ADNc o de péptidos sintéticos de escasa aparición, haciendo el escrutinio de genotecas mayores de 106 en el mejor de los casos laborioso y difícil. El escrutinio de 15 genotecas más grandes ha requerido el desarrollo de métodos diseñados para dirigir el aislamiento de secuencias de escasa aparición, que se basan en la selección simultánea de moléculas, junto con los ADN que las codifican. Se han desarrollado métodos in vivo para escrutar genotecas grandes, tales como la presentación en fagos y "péptidos sobre plásmidos" utilizando fusiones de péptidos lacI.

La presentación en fagos se basa en genotecas de ADN fusionadas al extremo N-terminal de las 20 proteínas de la envoltura de bacteriófagos filamentosos y su expresión en un anfitrión bacteriano, dando como resultado la presentación de péptidos foráneos sobre la superficie de la partícula de fago con el ADN que codifica la proteína de fusión empaquetado en la partícula de fago (Smith G. P., 1985, Science 228: 1315-1317). Las proteínas de fusión incorporadas en el fago, pueden ser seleccionadas después en busca de miembros de unión contra dianas de interés (ligandos). Luego se puede permitir que el fago unido re-infecte 25 bacterias Escherichia coli (E. coli) y después se amplifique y se repita la selección, dando como resultado el reclutamiento de miembros de unión (Parmley, S.F., y Smith, G. P. 1988., Gene 73: 305-318; Barrett R. W. et al., 1992, Analytical Biochemistry 204: 357-364 Williamson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4141-4145; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597).

La presentación en plásmidos de fusión lacI se basa en la capacidad de unión al ADN del represor 30 lac. Las genotecas de péptidos al azar se fusionan al extremo C-terminal de la proteína represora lacI. La unión de la fusión LacI-péptido a su ADN codificante se produce por medio de las secuencias lacO del plásmido, formando un complejo péptido-LacI-péptido estable. Estos complejos son liberados de su bacteria anfitriona mediante lisis celular, y los péptidos de interés son aislados mediante purificación por afinidad sobre una diana receptora inmovilizada. Los plásmidos aislados de ese modo pueden ser re-introducidos en E. coli 35 mediante electroporación para amplificar la población seleccionada para rondas adicionales de escrutinio (Cull, M. G. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 1865-1869).

Estos métodos bacterianos están limitados por el tamaño de la genoteca que se puede crear mediante los métodos actuales de introducción de ADN en la bacteria anfitriona, la toxicidad celular potencial de los péptidos expresados introducidos, y por la incapacidad para introducir modificaciones post-40 traduccionales, o para incorporar aminoácidos novedosos al péptido expresado.

Se ha descrito un sistema de ribosomas completamente in vitro basado en la conexión de péptidos al ARN que los codifica por medio del ribosoma (documento W091/05058). También se ha utilizado la presentación en ribosomas para la selección de fragmentos de anticuerpo Fv de cadena sencilla (scFv) (Matheakis, L. C. et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9022- 9026; Hanes, J. y Pluckthun, A. 1997 Proc. 45 Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4937-4942). Este método adolece de una menor estabilidad del material genético de ARN y un aumento de la degradación en ciertas condiciones de selección en las que es probable que esté presente la ARNasa.

El método in vitro descrito por Griffiths y Tawfik (documentos WO 99/02671 y WO 00/40712) trata algunos de estos asuntos mediante la compartimentalización de ADN antes de la expresión de los péptidos, 50 que después modifican el ADN en el compartimento. Los péptidos susceptibles de modificaciones, resultantes de la actividad enzimática de interés, son seleccionados después en una etapa posterior. Sin embargo, no es posible la selección directa de la actividad de unión al péptido tanto del péptido como del ADN sin modificación del ADN que codifica ese péptido, y mediante liberación del ADN modificado del compartimento.

Otro método de la técnica anterior, la tecnología de presentación covalente, o CDT, se describe en el 55 documento W09S37186. Este método se basa en el enlace covalente de la proteína al ADN para conservar la conexión del genotipo con el fenotipo, por medio de la acción cis de la proteína de entrecruzamiento. Este método ilustra que son necesarios dos requerimientos para un uso exitoso de esta técnica. En primer lugar, se

requieren proteínas que interaccionen in vitro con la secuencia de ADN que las codifica (acción cis), y en segundo lugar, dichas proteínas deben establecer un enlace covalente con su propio ADN molde. Este método adolece del hecho de que el ADN está modificado químicamente, lo que puede evitar la recuperación e identificación del péptido de unión de interés.

Sigue existiendo la necesidad de métodos in vitro más versátiles para construir genotecas peptídicas 5 además de los métodos descritos más arriba, que puedan permitir la selección directa de la actividad de unión, así como la actividad enzimática, y que permitan la producción eficaz de estructuras peptídicas complejas, a la vez que permiten aún la recuperación del material genético intacto que codifica el péptido de interés.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona por lo tanto un método para producir una genoteca de expresión 10 de péptidos in vitro que comprende una pluralidad de péptidos, donde cada péptido está conectado a un constructo de ADN que codifica el péptido, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un constructo de ADN que comprende:

(i) una secuencia diana de ADN;

(ii) ADN que codifica un péptido miembro de la genoteca; y 15

(iii) ADN que codifica un péptido capaz de unirse no covalentemente

directa o indirectamente a dicha secuencia diana de ADN

de (ii);

donde dichos constructo de ADN y proteína codificada se seleccionan

para que tengan actividad cis; 20

(b) expresar una pluralidad de constructos de ADN de acuerdo con (a),

donde dichos constructos de ADN codifican una pluralidad de péptidos miembros de la genoteca de manera que cada péptido expresado está unido no covalentemente al ADN del cual fue producido.

Asimismo se proporciona un método para producir una genoteca de expresión de péptidos in vitro 25 que comprende una pluralidad de péptidos, donde cada péptido está conectado al constructo de ADN que codifica el péptido, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un constructo de ADN que comprende:

(i) ADN que codifica un péptido miembro de la genoteca; y

(ii) ADN que codifica un péptido capaz de unirse no covalentemente a 30

un agente;

donde dichos constructo de ADN y proteína codificada se seleccionan

para que tengan actividad cis;

(b) unir dicho agente o una etiqueta de ADN capaz de unir un agente a

dicho constructo de ADN de (a), donde dicho agente es capaz de unirse al péptido codificado 35 por dicho ADN de (ii); y

(c) expresar una pluralidad de constructos de ADN de acuerdo con (b),

1. Un método para producir una genoteca de expresión de péptidos in vitro que comprende una pluralidad de péptidos, donde cada péptido está unido al constructo de ADN que codifica el péptido, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un constructo de ADN que comprende: 5

(i) una secuencia de ADN diana;

(ii) ADN que codifica un péptido miembro de la genoteca; y

(iii) ADN que codifica un péptido capaz de unirse no covalentemente

directamente o indirectamente a dicha secuencia diana de ADN de (i); donde dichos constructo de ADN y proteína codificada se seleccionan para que tengan actividad cis 10

(b) expresar una pluralidad de constructos de ADN de acuerdo con (a)

donde dichos constructos de ADN codifican una pluralidad de péptidos miembros de la genoteca de manera que cada péptido expresado está unido no covalentemente al ADN a partir del cual fue producido.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho constructo de ADN comprende 15 adicionalmente:

(iv) un elemento de ADN que dirige la actividad cis.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho constructo de ADN de (a) comprende adicionalmente

(v) ADN que codifica un fragmento que comprende al menos los 20 20

aminoácidos C-terminales de una proteína repA donde dicho fragmento es capaz de interaccionar con dicho elemento de ADN de (iv);

donde dicho elemento de ADN de (iv) está localizado 3' con respecto a dicho ADN de (ii), (iii) y (v).

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el péptido codificado por dicho ADN de (iii) es capaz de reconocer y unirse directamente a dicha secuencia diana de 25 ADN de (i).

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, donde el péptido codificado por dicho ADN de (iii) es una proteína repA y donde dicha secuencia diana de ADN de (i) es ori.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, donde dicho ADN de (ii) está conectado a dicho ADN de (i) y (iii) mediante digestión con enzimas de restricción y ligación. 30

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, donde dicho repA se selecciona entre repA de los plásmidos complejos IncI y repA de los plásmidos IncF, IncB, IncK, IncZ y IncL/M.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, donde dicho constructo de ADN comprende la secuencia que codifica repA, el elemento de ADN cis y el ADN ori del plásmido Rl de IncFII.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde dicha proteína 35 repA tiene la secuencia dada en el SEQ ID NO: 16 y donde dicho elemento de ADN cis tiene la secuencia dada en el SEQ ID NO: 17.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el ADN no unido por el péptido codificado por dicho ADN de (iii) es unido por una proteína de unión a ADN no específica.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, donde el péptido codificado por dicho ADN de (iii) 40 es un dominio de unión a ADN del receptor de estrógeno y donde dicha secuencia diana de ADN de (i) es una secuencia diana del receptor de estrógeno.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, donde dicho dominio de unión a ADN comprende los aminoácidos 176 a 282 del fragmento de unión a ADN del receptor de estrógeno y donde dicha secuencia diana de ADN comprende la secuencia diana del receptor de estrógeno dada en el SEQ ID NO: 14. 45

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, donde el péptido codificado por dicho ADN de (iii) se une indirectamente a dicha secuencia diana de ADN de (i) por medio de un agente, donde dicho

agente se une a dicha secuencia diana de ADN de (i) y donde dicho agente también se une al péptido codificado por dicho ADN de (iii).

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde dicha secuencia diana de ADN comprende una etiqueta de ADN susceptible de ser unida por dicho agente, seleccionándose opcionalmente dicha etiqueta entre biotina y fluoresceína. 5

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, donde las actividades de unión de dicho agente son conferidas por medio de dos anticuerpos o sus fragmentos.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, donde una o ambas de dichas actividades de unión son conferidas por medio de un fragmento Fab.

17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, donde dicho agente se 10 proporciona antes de la etapa (b).

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde dicho agente es unido a dicha secuencia diana de ADN de (i) y es capaz de unirse al péptido codificado por dicho ADN de (iii).

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, donde dicho agente es un polímero.

20. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho ADN 15 está bajo el control de secuencias promotoras y de traducción adecuadas para permitir la transcripción y la traducción in vitro.

21. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho péptido miembro de la genoteca es un anticuerpo o uno de sus fragmentos.

22. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha 20 genoteca comprende al menos 104 moléculas.

23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha expresión se lleva a cabo en presencia de un compuesto que evita la actividad nucleasa, o reduce las interacciones ADN-proteína o proteína-proteína no específicas.

24. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha 25 expresión se lleva a cabo en un entorno de transcripción/traducción bacteriano acoplado.

25. Un método de acuerdo con la reivindicación 24, donde dicho entorno de transcripción/traducción bacteriano acoplado es el sistema del extracto S30.

26. Un método para producir una genoteca de expresión de péptidos in vitro que comprende una pluralidad de péptidos, donde cada péptido está conectado al constructo de ADN que codifica el péptido, que 30 comprende las etapas de:

(a) proporcionar un constructo de ADN que comprende:

(i) ADN que codifica un péptido miembro de la genoteca; y

(ii) ADN que codifica un péptido capaz de unirse a un agente;

donde dichos constructo de ADN y proteína codificada se seleccionan para que tengan 35 actividad cis;

(b) unir dicho agente o una etiqueta de ADN capaz de unir un agente a

dicho constructo de ADN de (a), donde dicho agente es capaz de unirse al péptido codificado por dicho ADN de (ii); y

(c) expresar una pluralidad de constructos de ADN de acuerdo con (b), 40

donde dichos constructos de ADN codifican una pluralidad de péptidos miembros de la genoteca de manera que cada péptido expresado esté conectado por medio de dicho agente al ADN a partir del cual fue producido.

27. Un método de identificación y/o purificación de un péptido que muestra las propiedades deseadas a partir de una genoteca de expresión de péptidos in vitro producida de acuerdo con el método de una 45 cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos las etapas de (a) escrutar dicha genoteca y (b) seleccionar y aislar el miembro de la genoteca relevante.

28. Un método de identificación de un péptido de unión a un ligando específico, comprendiendo dicho método al menos las etapas de (a) escrutar una genoteca de expresión de péptidos in vitro producida de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 con moléculas de ligando que están opcionalmente unidas a un soporte sólido; (b) seleccionar y aislar un miembro de la genoteca que se une a dicha molécula de ligando; y (c) aislar el péptido que se une específicamente a dicha molécula de ligando. 5

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 27 o 28, donde dichos péptidos miembros de la genoteca son anticuerpos o sus fragmentos.

30. Un método de identificación y/o purificación de un péptido que tiene la capacidad de unirse a una secuencia diana de ADN específica que comprende al menos las etapas de

(a) proporcionar una genoteca de expresión in vitro de acuerdo con una 10

cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, donde el péptido codificado por el ADN de (iii) es un péptido miembro de la genoteca que tiene actividad de unión a ADN y donde dicha secuencia diana de ADN de (i) es la secuencia diana de interés;

(b) seleccionar y aislar un miembro de la genoteca en el que la proteína codificada se une a dicha secuencia diana; y 15

(c) aislar el péptido que se une a dicha secuencia diana.

31. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, donde dichos péptidos miembros de la genoteca son proteínas en dedo de cinc, proteínas hélice-bucle-hélice o proteínas hélice-giro-hélice.

32. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, donde dicha etapa de escrutinio y/o selección se lleva a cabo en presencia de un compuesto que evita la actividad 20 nucleasa o reduce las interacciones ADN-proteína o proteína-proteína no específicas.

33. Un método de acuerdo con la reivindicación 32, donde dicho compuesto es la heparina.

34. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, donde adicionalmente el ADN que expresa dicho péptido aislado es aislado.

35. Un método de acuerdo con la reivindicación 34, que comprende adicionalmente clonar dicho ADN 25 en un vector de expresión.

36. Un método de acuerdo con la reivindicación 35, que comprende adicionalmente introducir dicho vector de expresión en una célula in vitro.

37. Un método de acuerdo con la reivindicación 35 o 36, que comprende adicionalmente expresar el péptido codificado por dicho ADN. 30

38. Una genoteca de expresión de péptidos in vitro producida de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

39. Un constructo de ADN como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

40. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, donde dichos péptidos o péptidos miembros de la genoteca están anclados a polietilenglicol. 35