ANTICUERPOS SUPERHUMANIZADOS.

La invención se refiere a procedimientos para humanizar anticuerpos, en particular para humanizar anticuerpos fabricando anticuerpos quiméricos que contienen secuencias de CDR a partir de un anticuerpo no humano y secuencias estructurales de anticuerpos humanos, más particularmente a procedimientos de selección de secuencias estructurales apropiadas de anticuerpos humanos para realizar la humanización y, aún más particularmente, al uso de tipos de estructura canónica de CDR del anticuerpo no humano en comparación con tipos de estructura canónica de CDR de línea germinal de anticuerpos humanos como base para seleccionar las secuencias estructurales humanas apropiadas para un anticuerpo humanizado. Antecedentes de la invención Los anticuerpos son proteínas naturales que forman el sistema inmunitario de los vertebrados como respuesta a sustancias extrañas (antígenos), principalmente para la defensa contra infecciones. Durante un siglo, los anticuerpos se han inducido en animales en condiciones artificiales y se han recogido para su uso en la terapia o el diagnóstico de afecciones patológicas o para investigación biológica. Cada célula individual productora de anticuerpos produce un único tipo de anticuerpos con una composición químicamente definida, no obstante, los anticuerpos obtenidos directamente a partir de suero animal como respuesta a la inoculación de antígenos comprenden realmente un conjunto de moléculas no idénticas (es decir, anticuerpos policlonales) producido a partir de un conjunto de células individuales productoras de anticuerpos. La tecnología de hibridoma proporcionó un procedimiento para propagar una célula productora de anticuerpos durante un número indefinido de generaciones con un procedimiento de cribado para identificar clones de células que producen un anticuerpo que reaccionaría con un antígeno particular. El desarrollo de esta tecnología permitió la producción de cantidades ilimitadas de anticuerpos estructuralmente idénticos con, esencialmente, cualquier especificidad antigénica deseada. Dichos anticuerpos se denominan comúnmente anticuerpos monoclonales y se originan en su mayor parte en roedores. La secuenciación de genes de anticuerpos monoclonales permitió que se definiera la estructura primaria de aminoácidos de los anticuerpos. El advenimiento de la metodología de ADN recombinante permitió el diseño estructural de genes de anticuerpos y la producción de moléculas de anticuerpos modificadas con propiedades que no pueden obtenerse mediante la tecnología de hibridoma. En la escena terapéutica, un objetivo de esta metodología ha sido reducir la inmunogenicidad en seres humanos de anticuerpos monoclonales de roedor modificando su estructura primaria de aminoácidos. La reducción de la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos es deseable debido a que la inducción de una respuesta inmunitaria puede causar una serie de efectos secundarios en el paciente, variando desde la eliminación acelerada del anticuerpo terapéutico, con la consecuencia de la pérdida de eficacia, hasta la anafilaxia fatal en el caso más extremo. Un procedimiento para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales extraños ha consistido en reemplazar los dominios constantes de las cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal por dominios análogos de origen humano manteniendo intactos los dominios de las regiones variables del anticuerpo extraño. Los dominios de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada son responsables de la interacción entre el anticuerpo y el antígeno. Los dominios de unión que conectan los dominios variables a los dominios constantes están ubicados en una región alejada del sitio de unión al antígeno y, por lo tanto, los dominios de unión entre los dominios variables y los constantes no interfieren, generalmente, en la unión al antígeno. Las moléculas de anticuerpos quiméricos que tienen dominios variables de ratón unidos a dominios constantes humanos se unen al antígeno, generalmente, con la misma constante de afinidad que el anticuerpo de ratón a partir del que se deriva el anticuerpo quimérico. Dichos anticuerpos quiméricos son menos inmunogénicos en humanos que sus equivalentes totalmente murinos. No obstante, los anticuerpos que conservan dominios variables murinos enteros tienden a provocar respuestas inmunitarias en una fracción sustancial de pacientes. Por ejemplo, INFLIXIMAB®, un anticuerpo recetado ampliamente que se considera seguro, induce una respuesta de anticuerpos antiquiméricos humanos en 7 de cada 47 pacientes con enfermedad de Crohn. (Rutgeerts, P. y col (1999) Efficacy and safety of retreatment with anti-tumor necrosis factor antibody (INFLIXIMAB) to maintain remission in Crohn's disease. Gastroenterology 117, 761-769). El que los seres humanos producirían una respuesta inmunitaria a la totalidad de los dominios variables murinos era predecible; de este modo, los intentos de obtener dominios variables con un carácter más humano habían comenzado incluso antes de que se hubiera informado sobre los ensayos clínicos de dichos anticuerpos quiméricos estándar. Una categoría de procedimientos denominados frecuentemente humanización tienen el objetivo de convertir los dominios variables de anticuerpos monoclonales murinos en una forma más humana construyendo recombinantemente un dominio variable de anticuerpo que tenga un carácter tanto murino como humano. Los procedimientos de humanización se basan en distintas interpretaciones consensuadas de datos de estructuras de anticuerpos. Primeramente, los dominios variables contienen tramos contiguos de secuencias de péptidos que se 2 E02752269 26-07-2011   conservan dentro de una especie, pero que difieren entre especies evolucionariamente alejadas, tales como ratones y seres humanos. En segundo lugar, otros tramos contiguos no se conservan dentro de una especie, sino que también difieren incluso entre células productoras de anticuerpos dentro del mismo individuo. En tercer lugar, los contactos entre anticuerpo y antígeno tienen lugar principalmente a través de regiones no conservadas del dominio variable. En cuarto lugar, la arquitectura molecular de dominios variables de anticuerpos es lo suficientemente similar entre especies que las posiciones de los restos de aminoácidos correspondientes entre especies pueden identificarse solamente sobre la base de su posición, sin datos experimentales. Los procedimientos de humanización comparten la premisa de que el reemplazo de restos de aminoácidos que son característicos de secuencias murinas por restos encontrados en las posiciones correspondientes de anticuerpos humanos reducirá la inmunogenicidad en seres humanos del anticuerpo resultante. No obstante, el reemplazo de secuencias entre especies da como resultado, generalmente, la reducción de la unión del anticuerpo a su antígeno. La técnica de la humanización se basa, por lo tanto, en equilibrar el reemplazo de la secuencia murina original para reducir la inmunogenicidad con la necesidad de que la molécula humanizada conserve una unión al antígeno suficiente como para ser terapéuticamente útil. Este equilibrio se ha conseguido usando dos enfoques. En un enfoque, ejemplificado por medio del documento de patente de Estados Unidos Nº 5.869.619 de Studnicka y por Padlan (1991) A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand binding properties, Molecular Immunology 28:489-498, los restos humanos se sustituyen de forma característica por restos del dominio variable murino que se han determinado o predicho (i) para cumplir un papel químico poco importante en la interacción con el antígeno y (ii) para ubicarse con cadenas laterales que se proyectan en el disolvente. De este modo, los restos exteriores alejados del sitio de unión al antígeno están humanizados, mientras que los restos interiores, los restos de unión al antígeno y los restos que forman la interconexión entre dominios variables permanecen murinos. Una desventaja de este enfoque es que se requieren unos datos experimentales bastante amplios para determinar si un resto tiene un papel químico poco importante en la unión al antígeno o será ubicado en el disolvente en una estructura de anticuerpo particular de tres dimensiones. En otro enfoque más general, ejemplificado por el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.225.539 de Winter y por Jones y col. (1986) Replacing the complementarity determining regions in a human antibody with those from a mouse, Nature 321:522-525, tramos contiguos de la secuencia de péptidos del dominio variable murino que se consideran conservados se reemplazan por los tramos correspondientes de un anticuerpo humano. En este enfoque más general, todos los restos de los dominios variables están humanizados excepto en las regiones no conservadas implicadas... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para fabricar una molécula de anticuerpo quimérico, que comprende: determinar un tipo canónico de estructura de CDR para al menos dos CDR en una región variable sujeto de un anticuerpo sujeto; seleccionar una región variable objeto de un anticuerpo objeto sobre la base de si la región variable objeto tiene los mismos tipos canónicos de estructura CDR en ubicaciones correspondientes en la región variable objeto; y construir una molécula de anticuerpo quimérico que comprende una región variable quimérica que tiene las al menos dos CDR de una región variable sujeto injertadas en la secuencia estructural de la región variable objeto seleccionada en las ubicaciones correspondientes, en la que la secuencia estructural de la región variable quimérica difiere de la secuencia estructural de la región variable objeto seleccionada en no más de 10 restos de aminoácidos. 2. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende injertar cada una de las tres CDR de una región variable sujeto en las ubicaciones correspondientes en la secuencia estructural objeto. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que la secuencia estructural de la región variable quimérica difiere de la secuencia estructural de la región variable objeto en no más de 5 restos de aminoácidos. 4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia estructural de la región variable quimérica difiere de la secuencia estructural de la región variable objeto en no más de 2 restos de aminoácidos. 5. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que se selecciona la región variable objeto que incluye un conjunto de regiones variables objeto candidatas que tienen los mismos tipos de estructura de CDR canónicos que las CDR sujeto y clasificar el conjunto de regiones variables objeto comparando la similitud posición a posición de restos de aminoácidos de las CDR sujeto con las CDR objeto correspondientes de acuerdo con un criterio de ordenación. 6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la región variable objeto se selecciona de entre el 25 % superior de las regiones variables candidatas clasificadas. 7. El procedimiento de la reivindicación 5 ó la reivindicación 6, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de identidad de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos una CDR. 8. El procedimiento de la reivindicación 5 ó la reivindicación 6, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de identidad de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos dos CDR. 9. El procedimiento de la reivindicación 5 ó la reivindicación 6, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de identidad de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos tres CDR. 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de homología de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos una CDR. 11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de homología de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos dos CDR. 12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el criterio de clasificación incluye un registro de homología de aminoácidos entre las secuencias de CDR sujeto y objeto en las posiciones de restos correspondientes de al menos tres CDR. 13. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que las CDR son CDR definidas por Kabat. 14. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que las CDR son bucles de CDR definidas por Chothia. 15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en el que cada una de las tres CDR sujeto 96   es una CDR de cadena ligera, y si una de las tres secuencias de CDR sujeto es de un tipo de estructura canónico ausente de la región variable de cadena ligera objeto, entonces la actuación de seleccionar incluye también seleccionar una región variable objeto con una CDR de un tipo de estructura canónico diferente que el tipo de CDR sujeto que está ausente, con la condición de que el tipo de estructura canónico objeto diferente tenga una longitud de no más de 2 restos de aminoácidos menor o mayor que el tipo de estructura canónica sujeto que está ausente. 16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que si el tipo de estructura canónico de CDR ausente es del tipo canónico 1, entonces la actuación incluye seleccionar una región variable objeto con una CDR de tipo canónico 2 en la ubicación correspondiente, o si las secuencias de CDR sujeto son del tipo canónico 5 entonces la actuación incluye seleccionar una región variable objeto con un tipo canónico 4 ó 3 en la ubicación correspondiente. 17. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que además comprende la sustitución de al menos un resto de aminoácido de una secuencia de CDR sujeto por un aminoácido diferente, con la condición de que no se sustituyen más de 4 restos en cualquiera de la CDR1 de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera, CDR3 de cadena ligera, CDR1 de cadena pesada o CDR3 de cadena pesada sujeto y no se sustituyan más de 10 aminoácidos en la CDR2 de cadena pesada sujeto. 18. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que además comprende la sustitución de al menos un resto de aminoácido, pero no más de 10, de la secuencia estructural seleccionada por un resto de aminoácido diferente. 19. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que comprende fabricar regiones variables quiméricas para cada una de la cadena ligera y la cadena pesada. 20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que las cadenas ligeras variables quiméricas y las cadenas pesadas quiméricas se diseñan para formar una molécula seleccionada del grupo constituido por un fragmento Fab, una molécula (Fab)'2 y una molécula Fv de cadena única. 21. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que las cadenas ligeras variables quiméricas y las cadenas pesadas variables quiméricas se diseñan además para que incluyan un dominio de región constante de anticuerpo para el anticuerpo objeto forme un anticuerpo completo. 22. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la región variable sujeto es una región variable de ratón. 23. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la región variable objeto es una región variable humana. 24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la secuencia de región variable objeto se selecciona del grupo constituido por secuencias de Vk, V, VH, JH, Jk y J humanos. 25. El procedimiento de la reivindicación 24, que comprende fabricar regiones variables quiméricas para cada una de la cadena ligera y la cadena pesada, en el que las regiones variables quiméricas incluyen las estructuras de secuencias de Vk y VH humanos. 26. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que la región variable objeto seleccionada se codifica por un gen de región variable de línea germinal humana. 27. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que la región variable objeto seleccionada es de un anticuerpo humano maduro. 28. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que además comprende preparar un ácido nucleico que codifica la molécula de anticuerpo quimérica. 29. El procedimiento de la reivindicación 28, que además comprende expresar recombinantemente el ácido nucleico en un tipo de célula adecuado. 30. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, que además incluye la actuación de construir un conjunto de moléculas con regiones variables objeto diferentes, determinar una constante de disociación entre el antígeno y diferentes miembros del conjunto de moléculas y seleccionar una molécula que tenga una constante de disociación de al menos 10 6 M -1 , al menos 10 7 M -1 o al menos 10 8 M -1 . 97   98   99     101   102   103   104     106 9,3 9,3   107 9,3 9,3   108 9,3 9,3 9,3 9,3 9,3 9,3 9,3 9,3   9,3 9,3 9,3 109     111   112