Un polipéptido anti-EGFR que comprende al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra EGFR,

en el que dicho anticuerpo de dominio único procede de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente desprovisto de cadena ligera (VHH), y en el que dicho al menos un anticuerpo de dominio único es capaz de internalizar EGFR en células EGFR +

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona anticuerpos de dominio único de acuerdo con la reivindicación 1. La presente invención se refiere además a su uso en el diagnóstico y la terapia. Dichos anticuerpos pueden tener una secuencia de 5 región flanqueante con una alta homología con las secuencias de regiones flanqueantes humanas. Se describe una composición que comprende anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico en solitario o en combinación con otros fármacos.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El EGFR es parte de la familia de receptores ERBB, que tiene cuatro miembros estrechamente relacionados —EGFR 10 (ERBB1), HER2 (ERBB2), HER3 (ERBB3) y HER4 (ERBB4)—, que consisten en un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio tirosina quinasa intracelular (Yarden y col. 2001, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2, 127-137). La primera etapa en la estimulación mitogénica de células epidérmicas es la unión específica de ligandos tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el factor de crecimiento transformante alfa (TGF) a una glicoproteína de membrana conocida como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (receptor de EGF). 15 (Carpenter y col. 1979, Epidermal Growth Factor, Annual Review Biochem., Vol. 48, 193-216). El receptor de EGF está compuesto por 1.186 aminoácidos que se dividen en una porción extracelular de 621 restos y una porción citoplasmática de 542 restos conectadas por un solo segmento transmembrana hidrófobo de 23 restos. (Ullrich, y col. 1986, Human Epidermal Growth Factor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A-431 Epidermoid Carcinoma Cells, Nature, Vol. 309, 418-425). La porción externa del receptor de EGF puede subdividirse en 20 cuatro dominios. Se ha demostrado que el dominio I y III, flanqueados por dos dominios ricos en cisteína, contienen probablemente el sitio de unión a EGF del receptor (Ogiso y col. 2002. Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains. Cell 110, 775-787. Garrett y col. 2002. Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain bound to transforming growth factor alpha. Cell 110. 763-773.). La unión del EGF monovalente al dominio I y III conduce al inicio de las respuestas pleiotrópicas que 25 conducen a la síntesis de ADN y a la proliferación y diferenciación celular.

La unión del ligando monovalente a EGFR causa un cambio conformacional del dominio II del ectodominio del receptor, conduciendo a la dimerización del receptor que activa la actividad tirosina quinasa en el dominio intracelular. Esto conduce a la transfosforilación del receptor y al inicio de una miríada de cascadas de transducción de señales. La activación de EGFR se ha implicado en procesos involucrados en el crecimiento y la progresión tumoral, incluyendo la 30 proliferación celular, angiogénesis, metástasis, inhibición de la apoptosis y resistencia a radio- o quimioterapia. El EGFR se expresa en una amplia diversidad de tumores de origen epitelial, incluyendo >40% de CPNM (cánceres pulmonares no microcíticos), >95% de cánceres de cabeza y cuello, >30% de cánceres pancreáticos, >90% de carcinomas renales, >35% de cánceres de ovario, >40% de glioma y >31% de cánceres de vejiga (Salomon y col. 1995. Crit. Review Oncol. Hematol, 19, 183-232). Parece que los altos niveles de expresión de EGFR están asociados con progresión de la 35 enfermedad, aumento de la metástasis y mal pronóstico, proporcionando un fundamento sólido para desarrollar anticuerpos que se dirijan a EGFR eficaces para el tratamiento de diversos tumores sólidos. Se ha descubierto en diversos tipos de células tumorales humanas que esas células están caracterizadas por una desregulación de la señalización del receptor de EGF debido a una sobreexpresión del receptor y a la presencia de heterodímeros de EGFR de señalización constitutiva o formas mutantes de EGFR. Las células de cáncer de mama presentan una correlación 40 positiva entre la densidad de receptores de EGF y el tamaño tumoral y una correlación negativa con el grado de diferenciación. (Sainsbury y col. 1985, Epidermal Growth Factor Receptors and Oestrogen Receptors in Human Breast Cancer, Lancet, Vol. 1, 364-366; Sainsbury y col. 1985, Presence of Epidermal Growth Factor Receptor as an Indicator of Poor Prognosis in Patients with Breast Cancer, J. Clin. Path., Vol. 38, 1225-1228; Sainsbury y col. 1987. Epidermal-Growth-Factor Receptor Status as Predictor of Early Recurrence and Death From Breast Cancer, Lancet, Vol. 1, 1398-45 1400). Como los fibroblastos sinoviales y los queratinocitos son tipos celulares que también expresan receptor de EGF, estas células son células diana candidatas para el tratamiento de la artritis inflamatoria y de la psoriasis, respectivamente.

El EGFR se ha implicado también en varias otras enfermedades, tales como artritis inflamatoria (documentos US 5906820, US 5614488) e hipersecreción de moco en los pulmones (documentos US 6566324, US 6551989). 50

Muchos de los anticuerpos que se dirigen a EGFR tales como IMC-C225 (Erbitux, Imclone), EMD72000 (Merck Darmstadt), ABX-EGF (Abgenix), h-R3 (theraCIM, YM Biosciences) y Humax-EGFR (Genmab) se aislaron como anticuerpos que impiden la unión del ligando al receptor. Todavía ninguno de estos anticuerpos ni los fármacos actualmente disponibles son completamente eficaces para el tratamiento del cáncer y la mayoría están limitados por una grave toxicidad. Además, es extremadamente difícil y un proceso prologando desarrollar una nueva entidad química 55 (NEQ) con una potencia y selectividad suficientes para dicha secuencia diana. El objetivo principal en el tratamiento de tumores es destruir todas las células del tumor. Un agente terapéutico que destruye la célula se define como citotóxico. Un agente terapéutico que simplemente impide que las células se repliquen en lugar de destruir las células se define como citostático. Los compuestos terapéuticos basados en anticuerpos conocidos que se unen al receptor de EGF

simplemente impiden que las células se repliquen y, por lo tanto, dichos anticuerpos convencionales actúan como agente citostático (documentos EP 667165, EP 359282, US 5844093).

Por otro lado, los anticuerpos ofrecen un potencial significativo como fármacos debido a que tienen una especificidad exquisita hacia su diana y una baja toxicidad intrínseca. Además, el tiempo de desarrollo puede reducirse considerablemente cuando se compara con el desarrollo de nuevas entidades químicas (NEQ). Sin embargo, los 5 anticuerpos convencionales son difíciles de generar contra proteínas multiméricas en las que el dominio de unión a receptor del ligando está embebido en una hendidura o en la interfase entre las dos subunidades, como es el caso del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. Se sabe que los anticuerpos de cadena pesada descritos en la invención que proceden de Camelidae tienen una tendencia a unirse en cavidades (documento WO97/49805; Lauwereys y col, EMBO J. 17, 5312, 1998)). Por lo tanto, dichos anticuerpos de cadena pesada están intrínsecamente 10 adaptados a unirse a los dominios de unión a receptor de ligandos tales como EGF y, por lo tanto, pueden funcionar por un mecanismo de acción diferente para proporcionar un efecto citotóxico sobre células tumorales. Además, se sabe que dichos anticuerpos son estables durante periodos de tiempo prolongados, aumentando de este modo su vida media (Pérez y col, Biochemistry, 40, 74, 2001). Además, dichos fragmentos de anticuerpo de cadena pesada pueden producirse “en masa” en fermentadores usando sistemas de expresión baratos en comparación con la fermentación de 15 cultivos de células de mamífero tales como levaduras u otros microorganismos (documento EP 0 698 097).

El uso de anticuerpos derivados de fuentes tales como ratón, oveja, cabra, conejo, etc., y derivados humanizados de los mismos, como tratamiento para afecciones que requieren un efecto citostático o citotóxico sobre células tumorales es problemático por varias razones. Los anticuerpos...

1. Un polipéptido anti-EGFR que comprende al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra EGFR, en el que dicho anticuerpo de dominio único procede de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente desprovisto de cadena ligera (VHH), y en el que dicho al menos un anticuerpo de dominio único es capaz de internalizar EGFR en células 5 EGFR+.

2. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 1, que puede obtenerse por incubación de fagos recombinantes que expresan un repertorio de VHH clonados con células EGFR+, en condiciones para permitir la internalización de los fagos y la posterior liberación de los fagos internalizados.

3. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la célula EGFR+ se 10 selecciona de células HER-14 y A431.

4. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único corresponde a una secuencia representada por cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 o

a) una secuencia homóloga de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 con una identidad de secuencia de más del 70% con la secuencia precursora; 15

b) una porción funcional de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 que mantiene la interacción con la diana con una afinidad de 1 x 10-6 M o mejor,

c) una porción funcional de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 que comprende una deleción parcial de la secuencia de aminoácidos completa y todavía mantiene el sitio o sitios de unión y el dominio o dominios proteicos necesarios para la unión de y la interacción con EGFR. 20

5. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único corresponde a una secuencia representada por cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22, o a una secuencia homóloga de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 con una identidad de secuencia de más del 80% con la secuencia precursora.

6. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el al menos un 25 anticuerpo de dominio único corresponde a una secuencia representada por cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22, o a una secuencia homóloga de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 con una identidad de secuencia de más del 90% con la secuencia precursora.

7. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único compite por o inhibe la unión del ligando natural a EGFR. 30

8. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho ligando natural es EGF.

9. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único es capaz de unirse a su diana con una afinidad superior a 10-6 M.

10. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra una o más proteínas séricas. 35

11. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra una o más proteínas séricas se dirige contra cualquiera de albúmina sérica, inmunoglobulinas séricas, proteína de unión a tiroxina, transferrina o fibrinógeno, o un fragmento de las mismas.

12. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único es un dominio de VHH. 40

13. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único es un dominio de VHH que lleva un aminoácido del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, treonina, asparagina o glutamina en la posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat.

14.Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único 45 es un dominio de VHH que lleva un resto de arginina en la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat.

15. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicho dominio de VHH se obtiene por inmunización de un camélido y la obtención de un hibridoma a partir del mismo, o por clonación de una biblioteca de anticuerpos de dominio único y la posterior selección mediante el uso de presentación en fago.

16. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el al menos un 50 anticuerpo de dominio único es un VHH humanizado.

17. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único es humanizado por sustitución de uno o más de los aminoácidos de Camelidae por su homólogo humano como se encuentra en la secuencia de consenso humana.

18. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único es humanizado por sustitución de cualquiera de los restos siguientes en solitario o en 5 combinación: posiciones de la FR1 1, 5, 28 y 30, el aminoácido distintivo en la posición 44 y 45 de la FR2, restos de la FR3 74, 75, 76, 83, 84, 93 y 94, y posiciones 103, 104, 108 y 111 en la FR4; numeración de acuerdo con la numeración de Kabat.

19. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende además un anticuerpo de dominio único seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo de dominio único anti-IFN-gamma, 10 anticuerpo de dominio único anti-TNF-alfa, anticuerpo de dominio único anti-receptor de TNF-alfa y anticuerpo de dominio único anti-receptor de IFN-gamma.

20. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el número de anticuerpos de dominio único dirigidos contra EGFR es de al menos dos.

21. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 20, en el que los dos o más anticuerpos de dominio único 15 son diferentes en secuencia.

22. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 20, en el que los dos o más anticuerpos de dominio único son idénticos en secuencia.

23. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que los dos o más anticuerpos de dominio único están fusionados genéticamente a nivel de ADN. 20

24. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 23, en el que los anticuerpos de dominio único están unidos entre sí directamente.

25. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, que es una molécula bivalente, trivalente o tetravalente.

26. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende además un 25 vehículo que mejora la transferencia a través de la pared intestinal hacia el torrente sanguíneo.

27. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho vehículo es un VHH que se une específicamente a un receptor en la pared intestinal.

28. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, que comprende además un vehículo que aumenta el transporte del polipéptido desde la luz pulmonar hasta la sangre. 30

29. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 28, en el que dicho vehículo es un VHH que se une específicamente a un receptor sobre la superficie de la mucosa.

30. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 29, en el que dicho receptor es el receptor N de Fc (FcRn).

31. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30. 35

32. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31.

33. Una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones hasta la 30, o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, y un vehículo farmacéutico adecuado.

34. Una composición de acuerdo con la reivindicación 33, adaptada a la vía de administración seleccionada, es decir, por vía oral, vaginal, rectal, parenteral, intranasal, por inhalación, por vía sublingual, intravenosa, intramuscular, tópica o 40 subcutánea.

35. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 ó 34, adecuada para inyección o infusión.

36. Una composición terapéutica que comprende un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 en combinación con un agente antineoplásico o quimioterápico.

37. Una composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 36, para la administración separada de los 45 componentes.

38. Un polipéptido anti-EAFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, para su uso en el tratamiento y/o prevención de trastornos relacionados con procesos inflamatorios.

39. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, para su uso en el 5 tratamiento y/o prevención de cánceres epiteliales, tales como de pulmón, hígado, sistema nervioso central, hueso, sangre y sistema linfático, colon, mama, próstata, recto, vejiga, cabeza y cuello, ovario, testículo, pancreático y carcinoma de células escamosas.

40.Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, para su uso en el 10 tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunes, tales como enfermedad de Addison (glándula suprarrenal), enfermedades autoinmunes del oído (oído), enfermedades autoinmunes del ojo (ojo), hepatitis autoinmune (hígado), parotitis autoinmune (glándula parotidea), enfermedad de Crohn (intestino), diabetes Tipo I (páncreas), epididimitis (epidídimo), glomerulonefritis (riñones), enfermedad de Graves (tiroides), síndrome de Guillain-Barré (células nerviosas), enfermedad de Hashimoto (tiroides), anemia hemolítica (eritrocitos), lupus eritematoso sistémico (múltiples tejidos), 15 infertilidad masculina (esperma), esclerosis múltiple (células nerviosas), miastenia grave (unión neuromuscular), pénfigo (principalmente piel), psoriasis (piel), fiebre reumática (corazón y articulaciones), artritis reumatoide (revestimiento articular), sarcoidosis (múltiples tejidos y órganos), esclerodermia (piel y tejido conectivo), síndrome de Sjogren (glándulas exocrinas y otros tejidos), espondiloartropatías (esqueleto axial y otros tejidos), tiroiditis (tiroides), vasculitis (vasos sanguíneos). 20

41.Uso de un polipéptido o construcción polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, o de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno relacionado con procesos inflamatorios y cáncer.

42.Uso de un polipéptido o construcción polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, o de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o 25 cánceres epiteliales tales como de pulmón, hígado, sistema nervioso central, hueso, sangre y sistema linfático, colon, mama, próstata, recto, vejiga, cabeza y cuello, ovario, testículo, pancreático y carcinoma de células escamosas.

43.Uso de un polipéptido o construcción polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, o de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, para la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir enfermedades autoinmunes, tales como enfermedad de Addison (glándula suprarrenal), enfermedades autoinmunes del 30 oído (oído), enfermedades autoinmunes del ojo (ojo), hepatitis autoinmune (hígado), parotitis autoinmune (glándula parotidea), enfermedad de Crohn (intestino), diabetes Tipo I (páncreas), epididimitis (epidídimo), glomerulonefritis (riñones), enfermedad de Graves (tiroides), síndrome de Guillain-Barré (células nerviosas), enfermedad de Hashimoto (tiroides), anemia hemolítica (eritrocitos), lupus eritematoso sistémico (múltiples tejidos), infertilidad masculina (esperma), esclerosis múltiple (células nerviosas), miastenia grave (unión neuromuscular), pénfigo (principalmente piel), 35 psoriasis (piel), fiebre reumática (corazón y articulaciones), artritis reumatoide (revestimiento articular), sarcoidosis (múltiples tejidos y órganos), esclerodermia (piel y tejido conectivo), síndrome de Sjogren (glándulas exocrinas y otros tejidos), espondiloartropatías (esqueleto axial y otros tejidos), tiroiditis (tiroides), vasculitis (vasos sanguíneos).

44.Un procedimiento de producción de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, que comprende: 40

(a) cultivar células huésped que comprenden un ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido o construcción polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, y

(b) recuperar el polipéptido producido a partir del cultivo.

45. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 44, en el que dichas células huésped son células bacterianas, 45 células de levadura, células de mamífero o células de insecto.

46. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45, en el que dichas células huésped son células bacterianas o células de levadura.

47. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 46, en el que dichas células huésped son células de E. coli, células de S. cerevisiae o células de P. pastori. 50

48.Un procedimiento de diagnóstico de un trastorno caracterizado por la disfunción de EGFR, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30,

(b) detectar la unión de dicho polipéptido a dicha muestra, y

(c) comparar la unión detectada en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en la unión respecto a dicha muestra es diagnóstica de un trastorno caracterizado por una disfunción de EGFR.

49.Un kit para explorar un trastorno caracterizado por una disfunción de EGFR, que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30.

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