ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS.

Un anticuerpo biespecífico que consiste en tres dominios variables del anticuerpo sobre una cadena polipéptida única,

en el que una primera porción del anticuerpo biespecífico es capaz de reponer la actividad de una célula efectora inmune humana mediante la unión de manera específica a un antígeno efector localizado sobre la célula efectora inmune humana, en el que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano, estando constituida dicha primera porción de un dominio variable del anticuerpo, y una segunda porción del anticuerpo biespecífico es capaz de unirse de manera específica a un antígeno diana localizado sobre una célula diana distinta de dicha célula efectora inmune humana, en el que el antígeno diana es EpCAM humano, estando constituida dicha segunda porción de dos dominios variables del anticuerpo

La invención se refiere al campo de los anticuerpos. Específicamente, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico constituido de tres dominios variables del anticuerpo sobre una única cadena polipéptida. La invención se refiere además al uso de un anticuerpo biespecífico de este tipo para la preparación de una composición farmacéutica. Finalmente, la invención se refiere a un kit que comprende un anticuerpo biespecífico de este tipo.

La unificación de dos sitios de unión de antígeno de diferente especificidad en un constructo único, los anticuerpos biespecíficos tienen la capacidad de desarrollar conjuntamente dos antígenos discretos con exquisita especificidad y, en consecuencia, tienen gran potencial como agentes terapéuticos. Este potencial fue reconocido desde el principio, dando lugar a un cierto número de vías para la obtención de dichos anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos se obtuvieron originalmente mediante la fusión de dos hibridomas, cada uno de ellos capaz de producir una inmunoglobulina diferente. El hibridoma-híbrido resultante, o cuadroma, fue capaz de producir anticuerpos que portan la especificidad del antígeno del primer hibridoma progenitor así como el del segundo hibridoma progenitor (Milstein y otros, Nature, vol. 305, pág. 537, (1983)).Sin embargo, los hibridomas resultantes de cuadromas mostraban frecuentemente propiedades no deseadas debido a la presencia de una porción de anticuerpo Fc.

Debido en gran parte a dichas dificultades, los intentos posteriores se orientaron sobre la creación de constructos de anticuerpos resultante de la unión de dos fragmentos de anticuerpo scFv al mismo tiempo que se omitía la porción Fc presente en las inmunoglobulinas completas Cada unidad scFv en dichos constructos se formó de un dominio variable procedente de cada una de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) del anticuerpo, unidas entre sí mediante un ligador polipéptido sintético, siendo este último frecuentemente manipulado genéticamente con el fin de ser mínimamente inmunógeno y al mismo tiempo mantenerse máxima-mente resistente a la proteólisis. Las unidades scFv respectivas se unieron mediante un cierto número de técnicas incluyendo la incorporación de un espaciador polipéptido corto (usualmente menor de 10 aminoácidos) uniendo las dos unidades scFv, creando, de esta forma, un anticuerpo de cadena única biespecífico. En consecuencia, el anticuerpo de cadena única biespecífico resultante es una especie que contiene dos pares VH/VL de diferente especificidad sobre una cadena polipéptida única, en la que los dominios VH y VL en una unidad scFv respectiva están separados mediante un ligador polipéptido lo suficientemente largo como para permitir la asociación intramolecualr entre estos dos dominios, y en el que las unidades scFv así formadas están unidas de manera contigua entre sí mediante un espaciador polipéptido que las mantiene suficientemente cerca como para prevenir la asociación no deseada entre, por

ejemplo, el dominio VH de una unidad scFv y el VL de la otra unidad scFv.

Los anticuerpos de cadena única biespecíficos de la forma general descritos anteriormente tiene la ventaja de que la secuencia nucleótida conteniendo la codificación de cuatro dominios V, dos ligadores y un espaciador, puede incorporarse dentro de un organismo de expresión de huésped adecuado bajo el control de un promotor único. Esto incrementa la flexibilidad con la cual estos constructos pueden diseñarse así como el grado de control del experimentador durante su producción.

Se han obtenidos resultados experimentales señalados usando dichos anticuerpos de cadena única biespecíficos diseñados para el tratamiento de enfermedades malignas (Mack, J. Immunol., vol. 158, págs. 3965-70, (1997); Mack, PNAS, vol. 92, págs. 7021-5, (1995); Kufer, Cancer Immunol. Immunother., vol. 45, págs. 193-7, (1997); Löffler, Blood, vol. 95, págs. 2098103, (2000)) y enfermedades no malignas (Brühl, J. Immunol., vol. 166, págs. 2420-6, (2002)). En dichos anticuerpos de cadena única biespecíficos, una unidad scFv es capaz de activar células citotóxicas, por ejemplo células T citotóxicas, dentro del sistema inmune mediante unión específica a un antígeno sobre las células citotóxicas, en tanto que la otra unidad scFv se une específicamente a un antígeno sobre una célula maligna destinado a la destrucción. De esta forma, dichos anticuerpos de cadena única biespecíficos han mostrado activar y redireccionar el potencial citotóxico del sistema inmune hacia la destrucción de células especialmente malignas, patológicas. En la ausencia de un constructo de anticuerpo de cadena única biespecífico de este tipo, las células malignas proliferarían de otro modo sin ser inhibidas.

Sin embargo, los anticuerpos de cadena única biespecíficos deben cumplir exigencias adicionales. Con el fin de lograr la actividad deseada, cada unidad scFv de un anticuerpo de cadena única biespecífico debe de permanecer adecuadamente plegado, algo que se comprueba frecuentemente ser irrealizable en sistemas de expresión bacterianos convencionales tal como E. coli. La necesidad de usar sistemas de expresión, incluso mamíferos, eucarióticos menos convencionales, más incómodos y más costosos, complica frecuentemente la producción de anticuerpos de cadena única biespecíficos y/o reduce la cantidad de producto obtenible a niveles menores de los deseados para aplicación terapéutica.

En el caso de que un anticuerpo biespecífico esté destinado para uso terapéutico, es deseable producir altas cantidades de este anticuerpo de forma soluble y en la forma funcional deseada. La producción de anticuerpo funcionalmente activo llega a ser especialmente crítica cuando se producen anticuerpos biespecíficos de los cuales una porción es capaz de activar y reponer el potenciar citotóxico de las células efectoras inmunes humanas. Por ejemplo, un anticuerpo producido libre de actividad funcional no conducirá a la activación deseada de células efectoras inmunes humanas, en tanto que un anticuerpo biespecífico que es funcionalmente activo, aunque no en la manera deseada, tal como puede ser el caso, por ejemplo, cuando el anticuerpo biespecífico se produce en una forma heterogénea conteniendo múltiples isómeros, puede activar y reponer el potencial citotóxico de células efectoras inmunes humanas de maneras imprevisible y/o no propuesta.

Un ejemplo de la manera de activación no propuesta mencionada anteriormente es la posibilidad de activación de células efectoras inmunes humanas para ejercer un efecto sobre otras células efectoras inmunes humanas en lugar de sobre una célula diana destinada para destrucción. Este tipo de célula efectora inmune fratricida puede comprometer la eficacia de un régimen de terapia que depende de la actividad de células efectoras inmunes humanas. Sin embargo, la producción fiable de grandes cantidades de anticuerpo de cadena única funcional, especialmente grandes cantidades de anticuerpo de cadena única biespecífico funcional, a partir de sistemas de expresión procarióticos tal como E. coli está frecuentemente limitada, necesitando una costosa optimización (Baneyx, Curr. Op. in Biotechnol., vol. 10, págs. 411-12, (1999)).

Los polipéptidos multifuncionales de cadena única que comprenden al menos dos sitios de unión para CD19 y CD3 han sido descritos en la Patente WO 99/54440. De manera similar, la Patente WO 2004/106383 divulga un anticuerpo de cadena única biespecífico que comprende o está constituido por al menos dos dominios, en el que uno de los dominios se une a Ep-CAM humano y un segundo dominio se une a CD3 humano. No obstante, no se divulga específicamente un constructo de dominio variable de tres anticuerpos.

En resumen, los constructos de anticuerpo biespecíficos pueden ser de gran uso terapéutico en el redireccionamiento del potente potencial del sistema inmune propio del cuerpo para lograr la destrucción de células enfermas. Sin embargo, por su misma característica, la activación de medios potentes de este tipo de erradicación o neutralización de células no deseadas requiere que este poder sea controlado de manera tan precisa como sea posible de forma que el potencial citotóxico del sistema inmune sea repuesto y aplicado únicamente en la dirección deseada y no en otra.

Obviamente, cuando un instrumento de unión específico de un anticuerpo de cadena única biespecífico es para reponer la actividad de una célula efectora inmune humana, por ejemplo una célula T citotóxica, existe una necesidad especialmente perfeccionada y, hasta ahora, no encontrada...

1. Un anticuerpo biespecífico que consiste en tres dominios variables del anticuerpo sobre una cadena polipéptida única, en el que

una primera porción del anticuerpo biespecífico es capaz de reponer la actividad de una célula efectora inmune humana mediante la unión de manera específica a un antígeno efector localizado sobre la célula efectora inmune humana, en el que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano, estando constituida dicha primera porción de un dominio variable del anticuerpo, y

una segunda porción del anticuerpo biespecífico es capaz de unirse de manera específica a un antígeno diana localizado sobre una célula diana distinta de dicha célula efectora inmune humana, en el que el antígeno diana es EpCAM humano, estando constituida dicha segunda porción de dos dominios variables del anticuerpo.

2. Un anticuerpo biespecífico que consiste en tres dominios variables del anticuerpo sobre una cadena polipéptida única, en el que

una primera porción del anticuerpo biespecífico es capaz de reponer la actividad de una célula efectora inmune humana mediante la unión de manera específica a un antígeno efector localizado sobre la célula efectora inmune humana, en el que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano, estando constituida dicha primera porción de dos dominios variables del anticuerpo, y

una segunda porción del anticuerpo biespecífico es capaz de unirse de manera específica a un antígeno diana localizado sobre una célula diana distinta de dicha célula efectora inmune humana, en el que el antígeno diana es EpCAM humano, estando constituida dicha segunda porción de un dominio variable del anticuerpo.

3. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación anterior 1 ó 2, en el que la primera y segunda porciones se obtienen de la misma o diferente especie.

4. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 3, en el que la primera y/o segunda porción se obtiene/obtienen de manera independiente de una especie de primate, roedor, tilópodo o pez cartilaginoso.

5. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 4, en el que la primera y/o segunda porción obtenida de primate se obtiene/obtienen de un humano.

6. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 4, en el que la primera y/o segunda porción obtenida de roedor se obtiene/obtienen de ratón o rata.

7. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 6, en el que la primera y/o segunda porción obtenida de ratón o rata es un dominio variable procedente de la cadena pesada (VH)

obtenida de ratón o rata.

8. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 4, en el que la primera y/o segunda porción obtenida de tilópodo se obtiene/obtienen de camello, llama o dromedario.

9. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 8, en el que la primera y/o segunda porción obtenida de camello, llama o dromedario es un dominio VHH.

10. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo biespecífico ha experimentado una alteración para hacerle menos inmunógeno cuando se administra a seres humanos.

11. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 10, en el que la alteración comprende una o más de las técnicas siguientes: quimerización, humanización, injertado de CDR, desinmunización, mutación del marco de lectura de aminoácidos para corresponder a la secuencia de la línea germinal humana más próxima (germinalización).

12. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo tiene una secuencia tal como se establece en la SEC ID NO:1.

13. Una secuencia nucleótida que codifica el polipéptido que tiene la secuencia tal como se representa en la SEC ID NO:1, o una secuencia nucleótida que muestra al menos 70% de homología con dicha secuencia nucleótida, en el que la homología se determina comparando una secuencia nucleótida que codifica la SEC ID NO:1 con una secuencia nucleótida en cuestión mediante alineación de secuencias,

en el que un nucleótido en la secuencia en cuestión se considera homóloga si es o bien idéntica al nucleótido correspondiente en la secuencia nucleótida que codifica la SEC ID NO:1,

o bien si la desviación en un nucleótido en la secuencia en cuestión con respecto al nucleótido correspondiente en la secuencia nucleótida que codifica la SEC ID NO:1 da como resultado un triplete nucleótido, el cual, cuando se traduce, da como resultado un aminoácido que es o bien idéntico o bien una substitución conservadora del aminoácido en la posición correspondiente en el polipéptido que tiene la secuencia tal como se representa en la SEC ID NO:1, siendo capaz una primera porción del polipéptido de reponer la actividad de una célula efectora inmune humana mediante la unión de manera específica a un antígeno efector localizado sobre la célula efectora inmune humana, en el que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano, estando constituida dicha primera porción de un dominio variable del anticuerpo, y

siendo capaz una segunda porción del polipéptido de unirse de manera específica a un antígeno diana localizado sobre una célula diana distinta de dicha célula efectora inmune humana, en el que el antígeno diana es EpCAM humano, estando constituida dicha segunda porción de dos dominios variables del anticuerpo.

14. Uso de un anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o una secuencia nucleótida de la reivindicación 13, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad tumoral.

15. Un kit que comprende un anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1-12.