USO DE POLIMEROS ACTIVADOS PARA LA SEPARACION DE MULTIMEROS PROTEICOS Y POLIPEPTIDICOS.

Uso de un polímero activado para separar un multímero polipeptídico asociado no covalentemente,

que comprende múltiples subunidades polipeptídicas, en múltiples subunidades polipeptídicas, en el que

- el polímero activado comprende una fracción química mediante la cual el polímero puede enlazarse covalentemente a la subunidad polipeptídica en el multímero polipeptídico asociado no covalentemente.

- el polímero activado es un polietilenglicol activado, un polidextran activado o una poli-L-lisina activada, y

- cada una de las subunidades polipeptídicas comprende una cadena polipeptídica única; y/o un grupo de al menos dos cadenas polipeptídicas únicas, en las que al menos dos cadenas polipeptídicas únicas están enlazadas covalentemente, una a la otra, y en las que al menos una de las subunidades polipeptídicas comprende un anticuerpo de cadena única que comprende al menos una región variable de anticuerpo

Uso de polímeros activados para la separación de multímeros proteicos y polipeptídicos.

La presente invención se refiere a un uso de polímeros activados. Específicamente, la presente invención se refiere a un uso de polímeros activados en el campo de la preparación de proteínas y/o polipéptidos.

Tras una expresión recombinante, las moléculas proteicas y/o polipeptídicas existen frecuentemente en una o más isoformas, es decir, estas moléculas exhiben frecuentemente heterogenicidad de producto. Como ejemplo particularmente bien estudiado, se conoce que los anticuerpos de cadena única, o scFvs, existen tras una expresión recombinante como una mezcla de especies monoméricas y multiméricas, principalmente diméricas. Las especies monoméricas resultan de la asociación covalente o no covalente de las regiones variables del anticuerpo en la misma cadena polipeptídica, unas con las otras. Por otra parte, las especies diméricas resultan de una asociación de la primera cadena polipeptídica y de la segunda cadena polipeptídica, comprendiendo cada una, por ejemplo, dos regiones variables A y B complementarias del anticuerpo, una con la otra, de manera que la región variable A de la primera cadena polipeptídica se asocia con la región variable B de la segunda cadena polipeptídica, y viceversa. Estas especies son conocidas normalmente como un diacuerpo (Hudson et al. (1999) J. Immunol. Met. 231, 177-189).

En los casos en que los polipéptidos están destinados a un uso terapéutico posterior, dicha heterogenicidad de producto es generalmente no deseable, ya que los productos heterogéneos exhiben frecuentemente propiedades farmacocinéticas o actividades biológicas distintas. En el desarrollo de un polipéptido terapéutico, es importante poder predecir como actuará este polipéptido in vivo (es decir, su modo de acción cualitativo) así como la magnitud de esta actividad biológica (es decir, su eficacia cuantitativa y su distribución en el cuerpo). Dichas predicciones son frecuentemente difíciles de realizar con seguridad para productos heterogéneos (Moore et al. (1999) Biochemistry. 38, 13960-13967).

Sin embargo, también puede ser problemático crear un producto homogéneo que permanezca como tal. Esto es así debido a que la heterogenicidad del polipéptido es frecuentemente el resultado de un equilibrio termodinámico entre el polipéptido monomérico y el multimérico; tras la retirada de una de las especies, el equilibrio se restablece entre ambas especies (Lee et al. (2002) J. Mol. Biol. 320,107-127). Esto se aplica tanto a la fracción retirada como a la fracción restante, de manera que un tiempo después de una separación cromatográfica, cada fracción exhibirá aproximadamente la misma relación monómero:multímero, siendo esta relación el resultado de la equilibración isomérica entre ambas o entre todas las especies de polipéptidos. Entonces, una simple retirada cromatográfica de una de las especies polipeptídicas representa frecuentemente solo una solución temporal al problema de la heterogenicidad del producto, ya que frecuentemente existe un impulso termodinámico natural hacia un producto heterogéneo. Este problema puede ser salvado mediante la conversión de un producto purificado deseado en una forma en la que la equilibración termodinámica entre las isoformas ya no pueda ocurrir, por ejemplo, en un producto liofilizado. A continuación, este producto liofilizado es reconstituido inmediatamente antes de la administración en el punto de tratamiento, de manera que se eliminan una equilibración termodinámica no deseada y un incremento concomitante en la heterogenicidad del producto o al menos se mantienen en un mínimo absoluto. Sin embargo, la separación de la isoforma no deseada de una mezcla heterogénea resulta frecuentemente en una pérdida considerable de producto polipeptídico.

Independientemente de los problemas de la heterogenicidad polipeptídica, el desarrollador de los polipéptidos terapéuticos se encuentra frecuentemente con la necesidad de modular las propiedades farmacocinéticas y/o inmunogénicas del polipéptido destinado a ser administrado. Por ejemplo, el polipéptido destinado para terapia puede ser eliminado del suero del paciente demasiado rápidamente para provocar cualquier efecto terapéutico, un problema que generalmente se convierte en más intratable cuanto más pequeño es el peso molecular del polipéptido. La tasa de eliminación de un polipéptido terapéutico del suero de un paciente puede ser acelerada sin desearlo si el polipéptido desencadena una respuesta inmunogénica, es decir, si el sistema inmune del paciente monta una respuesta inmune al material extraño. Por cada una de estas razones, es frecuentemente deseable derivar un polipéptido destinado para la administración a un paciente, de manera que se extienda la vida media en suero y se reduzca la inmunogenicidad del polipéptido, siendo lo primero un resultado, al menos en parte, de lo último.

Estos objetivos se han cumplido mediante una conjugación de polímeros orgánicos extendidos con polipéptidos terapéuticos. Para citar un ejemplo en la literatura, se ha usado una conjugación de polipéptidos con polietilenglicol ("PEG") con este fin (Roberts et al. (2002) Adv. Drug Delivers Rev. 54, 459-476). La conjugación con polímeros orgánicos extendidos incrementa el peso molecular efectivo de los polipéptidos mientras que, al mismo tiempo, los protege del reconocimiento por el sistema inmune, cada uno de los cuales tiene el efecto de que la vida media en suero del polipéptido se extiende ventajosamente.

Por lo tanto, el desarrollador de polipéptidos terapéuticos se encuentra frecuentemente con el reto doble de generar un producto homogéneo mejorando al mismo tiempo las propiedades farmacocinéticas y/o inmunogénicas de este producto. Combinadas, estas consideraciones necesitan numerosas etapas secuenciales de aislamiento, purificación y conjugación, cada una de las cuales resulta en una pérdida de producto y tiempo y, en general, en una complejidad y un coste añadidos a todo el proceso de producción. Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar una manera alternativa, más concertada, de abordar los problemas mencionados anteriormente.

Los inventores de la presente invención han descubierto ahora sorprendentemente que la conjugación de polipéptidos con polímeros extendidos resulta no solo en las ventajas ya reconocidas para dichos polímeros (es decir, mejora de las propiedades farmacocinéticas y/o inmunogénicas de un producto), sino también en la separación de polipéptidos multiméricos en polipéptidos monoméricos conjugados en una manera permanente.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere al uso de un polímero activado para separar un multímero polipeptídico asociado no covalentemente, que comprende múltiples subunidades polipeptídicas, en dichas múltiples subunidades polipeptídicas, según las reivindicaciones adjuntas.

Según este aspecto de la invención, se usa un polímero, preferentemente un polímero orgánico, en una forma activada. El término "activada" se refiere a cualquier forma del polímero que comprenda una fracción química mediante la cual el polímero pueda ser enlazado covalentemente a una subunidad polipeptídica en el multímero polipeptídico asociado no covalentemente. Debido a que un polímero que comprende dicha fracción retendrá esta fracción tras enlazarse covalentemente a la subunidad polipeptídica, el término "polímero activado", tal como se usa en la presente memoria, se refiere al polímero tanto antes como también después del acoplamiento a la subunidad polipeptídica, es decir, un polímero activado que ya ha formado un enlace covalente con una subunidad polipeptídica será denominado todavía como un "polímero activado". Preferentemente, la fracción química para el enlace covalente al polipéptido reaccionará bajo condiciones fisiológicas o condiciones cercanas a las fisiológicas, o al menos bajo condiciones que no serán dañinas para las subunidades polipeptídicas del multímero polipeptídico asociado no covalente- mente.

La expresión "multímero polipeptídico asociado no covalentemente" debe entenderse que abarca cualquier especie polipeptídica que comprende al menos dos cadenas polipeptídicas que pueden separarse una de la otra sin romper ningún enlace químico covalente. La asociación puede ser de una naturaleza ordenada, por ejemplo del tipo observado entre dos polipéptidos que son complementarios estéricamente y/o electrostáticamente uno respecto al otro. Como un ejemplo de dicha asociación ordenada, puede...

1. Uso de un polímero activado para separar un multímero polipeptídico asociado no covalentemente, que comprende múltiples subunidades polipeptídicas, en múltiples subunidades polipeptídicas, en el que