Un anticuerpo o proteína de fusión de clase IgG, que comprende una región constante de la cadena pesada o porción FcRn de la misma de una molécula de IgG humana,

que comprende ácido glutámico o glutamina en el residuo de aminoácido 250 y leucina o fenilalanina en el residuo de aminoácido 428 y en el que los residuos de aminoácidos están numerados por el sistema de numeración de UE

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a los campos de la nmunología y de la ingeniería proteica. En particular, se refiere a anticuerpos modificados de IgG de clase que tienen alteradas las afinidades de unión por FcRn o alteradas las semividas en suero como consecuencia de una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los anticuerpos son proteínas que exhiben especificidad de unión por un antígeno concreto. Los anticuerpos nativos (es decir, naturales o salvajes) normalmente son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Como se muestra en la Figura 1, cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace covalente disulfuro, aunque el número de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina varía. Cada cadena pesada tiene, en un extremo, un dominio variable (VH) seguido por una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en el otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada.

Ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y son responsables de la especificidad de unión de cada anticuerpo concreto a su antígeno concreto. Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras. En función de la secuencia de aminoácidos de la región constante de las cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales (isotipos) de inmunoglobulinas en seres humanos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas pueden además dividirse en subclases (subtipos), tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, así como IgA1 e IgA2.

Una representación esquemática de la estructura de IgG nativa se muestra en la Figura 1, en la que están indicadas las diversas porciones de la molécula de anticuerpo nativo. La región constante de la cadena pesada incluye CH1, la región bisagra, CH2, y CH3. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos, Fab y Fc. El fragmento Fc consta de CH2, CH3, y parte de la region bisagra. Se ha determinado la estructura cristal del fragmento Fc de la IgG1 humana (Deisenhofer, Biochemistry 20:2361-2370 (1981)). En las moléculas de IgG humanas, el fragmento Fc se genera mediante escisión con papaína de la región bisagra N-terminal a Cys 226. Por tanto, la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana normalmente se define como la extensión desde el residuo de aminoácido en la posición 226 al extremo C (numerado de acuerdo con el índice de la UE de Kabat, y coI., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5ª ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); en lo sucesivo en el presente documento se usa el esquema de numeración de la UE).

La región Fc es esencial para las funciones efectoras de los anticuerpos. Las funciones efectoras incluyen iniciar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), iniciar la fagocitosis y la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (AD-CC) y transferir los anticuerpos a través de las barreras celulares mediante transcitosis. Además, la región Fc es crucial para mantener la semivida en suero de un anticuerpo de clase IgG (Ward y Ghetie, Ther. Immunol. 2:77-94 (1995)).

En los estudios se ha descubierto que la semivida sérica de un anticuerpo IgG está mediada por la unión de Fc al receptor de Fc neonatal (FcRn). El FcRn es un heterodímero constituido por una cadena α transmembrana y una cadena β soluble (β2-microglobulina). El FcRn comparte un 22-29% de identidad de secuencia con las moléculas de MHC de clase I y tiene una versión no funcional de la ranura de unión péptido-MHC (Simister y Mostov, Nature 337:184-187 (1989)). Los dominios α1y α2 de FcRn interaccionan con los dominios CH2 y CH3 de la región Fc (Raghavan y coI., Immunity 1:303-315 (1994)).

Se ha propuesto un modelo para como FcRn podría regular la semivida sérica de un anticuerpo. Como se muestra en la Figura 2, las IgG son captadas por las células endoteliales a través de pinocitosis no específica y, después, entran en los endosomas ácidos. FcRn se une a IgG a un pH ácido (<6,5) en los endosomas y liberan IgG a un pH básico (> 7,4) en la corriente sanguínea. De acuerdo con esto, la FcRn salva a la IgG de una vía de degradación lisosomal. Cuando los niveles de IgG en suero disminuyen, se dispone de más moléculas de FcRn para la unión a IgG de modo que se salva un incremento de la cantidad de IgG. Por el contrario, si los niveles de IgG en suero aumentan, el FcRn se satura y, de este modo, se incrementa la proporción de IgG pinocitosada que se degrada (Ghetie y Ward, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000)).

Consistente con el modelo anterior, los resultados de numerosos estudios avalan una correlación entre la afinidad de la unión de FcRn y la semivida en suero de un anticuerpo (Ghetie y Ward, ibid.). Es significativo el hecho de que dicha correlación se ha extendido a anticuerpos sometidos a ingeniería con mayor afinidad por FcRn que sus moléculas parentales salvajes.

Ghetie et al. realizaron una mutagénesis aleatoria en la posición 252, la posición 254 y la posición 256 en un fragmento de bisagra de Fc de IgG1 de ratón. Un mutante mostró una afinidad tres veces y media superior para la FcRn de ratón y una semivida de aproximadamente 23% o 65% mayor en dos cepas de ratón, respectivamente, en comparación con las del tipo salvaje (Ghetie y coI., Nat. Biotechnol. 15:637-640 (1997)).

Shields y col. usaron mutagénesis de barrido con Alanina para alterar los residuos en la region Fc de un anticuerpo IgG1 humano y, después, evaluaron la unión a FcRn humano. Encontraron varios mutantes con una afinidad de unión mayor por FcRn humano que el tipo salvaje, pero no identificaron mutaciones en las posiciones 250, 314 o 428 (Shields y coI., J. BioI. Chem. 276: 6591-6604 (2001 )).

Martin y col. propusieron la mutagénesis en una serie de posiciones en la Fc de la IgG humana para incrementar la unión a FcRn, incluidas, entre muchas otras, las posiciones 250, 314 y 428. No obstante, ninguno de los mutantes propuestos por Martin y col. se construyó o analizó según su unión a FcRn (Martin y col., Mol. Cell 7:867-877 (2001 )).

Dall'Acqua et al. han descrito la mutagénesis aleatoria y detección selectiva de bibliotecas de expresión en fagos del fragmento Fc-bisagra de IgG1 humana frente al FcRn de ratón. Divulgaron la mutagénesis aleatoria de las posiciones 428-436, pero no identificaron que la mutagénesis en la posición 428 tuviera ningún efecto sobre la afinidad de unión a FcRn de ratón e indicaron que el aminoácido salvaje, metionina, en esta posición es favorable a una unión eficaz (Dall'Acqua y col., J. Immunol. 169:5171-5180 (2002)).

Kim y col. realizaron mutagénesis en la IgG1 humana mediante sustituciones de aminoácidos en la posición 253, la posición 310 o la posición 435 de la región Fc. Encontraron que los fragmentos mutantes de Fc-bisagra tienen semividas reducidas en ratones en comparación con el fragmento Fc-bisagra de IgG1 salvaje y concluyeron que lIe253, His310 y His435 desempeñan un papel fundamental en la regulación de la semivida en suero de IgG (Kim y coI., Eur. J. Immunol. 29:2819-2825 (1999)).

Hornick y col. mostraron que una sustitución de un único aminoácido en la posición 253 en la region Fc de un anticuerpo IgG1 humano quimérico acelera el aclaramiento en ratones y mejora la inmunocentelleo de los tumores sólidos (Hornick y col., J. Nucl. Med. 41 :355-362 (2000)).

La patente de EE.UU. nº 6.165.745 divulga un procedimiento de producir un anticuerpo con una menor semivida biológica mediante la introducción de una mutación en el segmento de ADN que codifica el anticuerpo. La mutación incluye una sustitución de aminoácido en las posiciones 253, 310, 311, 433 ó 434 del dominio Fc-bisagra.

Las patentes de EE.UU. números 5.530.101; 5.585.89; 5.693.761; 5.693.762; y

6.180.370 divulgan la humanización de inmunoglobulinas..

La patente de EE.UU. nº 6.277.357 B1 divulga una composición que comprende una molécula de IgG mutante que tiene una mayor semivida en suero con respecto...

1. Un anticuerpo o proteína de fusión de clase IgG, que comprende una región constante de la cadena pesada o porción FcRn de la misma de una molécula de IgG humana, que comprende ácido glutámico o glutamina en el residuo de aminoácido 250 y leucina o fenilalanina en el residuo de aminoácido 428 y en el que los residuos de aminoácidos están numerados por el sistema de numeración de UE.

2. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula de IgG humana es una molécula de IgG1, IgG2, IgG2M3, IgG3 o IgG4 humana

3. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula de IgG humana es una molécula de IgG1 o IgG2M3 humana.

4. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el residuo de aminoacido 250 de la región constante de la cadena pesada es glutamina.

5. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el residuo de aminoacido 428 de la región constante de la cadena pesada es leucina.

6. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en el que

a) dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada es ácido glutamico y el residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada es fenilalanina.

b) dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada es glutamina y el residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada es fenilalanina; o

c) dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada es glutamina y el residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada es leucina;.

7. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada es glutamina y dicho residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada es leucina.

8. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o proteína de fusión tiene una afinidad de unión por FcRn mayor a pH 6,0 que a pH 7,4.

9. Un anticuerpo o proteína de fusión que comprende una región constante sustancialmente idéntica al anticuerpo humano de clase IgG natural, en el que

a) al menos los reisudos de aminioácido de la regió constante de la cadena pesada 250 y 428 son diferentes de los residuos presentes en el anticuerpo IgG natural con ácido glutámico o glutamina en el residuo de aminoácido 250 y leucina o fenilalanina en el residuo de aminoácido 428.

b) la semivida en suero in vivo de dicho anticuerpo está incrementada en relación con el anticuerpo natural, y

c) en el que los residuos de aminoácido están numerados mediante el sistema de numeración de la UE.

10. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el dicho anticuerpo humano de clase Ig natural comprende una región constante de la cadena pesad de una molécula IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana.

11. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el dicho anticuerpo humano de clase Ig natural comprende una región constante de la cadena pesad de una molécula IgG1 humana.

12. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada es glutamina.

13. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada es leucina.

14. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en el que

a) dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada es ácido glutámico y dicho residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada es fenilalanina.

b) dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada es glutamina y dicho residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada es fenilalanina; o

c) dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada es glutamina y dicho residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada es leucina;.

15. El anticuerpo o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada es glutamina y dicho residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada es leucina.

16. Un procedimiento para alterar la afinidad de unión por FcRn y/o la semivida en suero de un anticuerpo o proteína de fusión de clase IgG que comprende sustituit los residuos de aminoácidos 250 y 428 en un anticuerpo de clase IgG humano matural, no modificado en el que el residuo 250 es ácido glutámico o glutamina, y el residuo de aminoácido 428 es leucina o fenilalanina, por lo que se altera la afinidad de unión por FcRn y/o la semivida en suero del anticuerpo, en el que los residuos de aminoácidos están numerados con el sistema de numeración de la UE.

17. Un procedimiento de producir un anticuerpo o proteína de fusión de clase IgG, que comprende:

a) preparar un vector de expresión, que comprende un promotor adecuado unido de forma operable a ADN que codifica al menos una región constante o una porción de unión a FcRn de la misma de una cadena pesada de inmunoglobulina humana o una porción de unión a FcRn de la misma, en la que el residuo de aminoácido 250 está sustituido con ácido glutámico o glutamina y el residuo de aminoácido 428 está sustituido con fenilalanina o leucina;

b) transformar las células huésped con dicho vector; y

c) cultivar dichas células huésped transformadas para producir dicho anticuerpo o proteína de fusión, en el que los residuos de aminoácidos están numerados mediante el sistema de numeración de la UE.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, que además comprende: preparar un segundo vector de expresión que comprende un promotor ligado operablemente a

ADN que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina complementaria y transformar dichas células huésped con dicho segundo vector de expresión.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada está sustituido con glutamina.

20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada está sustituido con leucina.

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que:

a) dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada está sustituido con ácido glutámico y el residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada está sustituido con fenilalanina.

b) dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada está sustituido con glutamina y el residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada está sustituido con fenilalanina; o

c) dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada está sustituido con glutamina y el residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada está sustituido con leucina.

22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho residuo de aminoácido 250 de la región constante de la cadena pesada está sustituido con glutamina y dicho residuo de aminoácido 428 de la región constante de la cadena pesada está sustituido con leucina.

23. El anticuerpo o proteína de fusión o procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el anticuerpo o proteína de fusión es un anticuerpo o proteína de fusión terapéutica o profilática.

24. El anticuerpo de la reivindicación 23, que está modificado de daclizumab por el ácido glutámico o glutamina en el residuo de aminoácido 250 y leucina o fenilalanina en el residuo de aminoácido 428.

25. El anticuerpo de la reivindicación 23, que está modificado a partir de cualquiera de los anticuerpos siguiente:

palivizumab, trastuzumab, infliximab, abciximab, bevacizumab, cetuximab, alemtuzumab, rituximab, efalizumab, visilizumab, adalimumab, natalizumab, o basiliximab, por el ácido glutámico o glutamina en el residuo de aminoácido 250 y leucina o fenilalanina en el residuo de aminoácido 428.