TRANSFORMACION DE PLANTAS MEDIANTE ENSAMBLAJE EN VIVO DE UNA SECUENCIA DE INTERES.
Un proceso para producir plantas o células vegetales transgénicas transformadas de manera estable en un cromosoma con una secuencia de ADN de interés y capaces de expresar una función de interés a partir de dicha secuencia de ADN de interés,
comprendiendo dicho proceso
(a) la provisión a células vegetales o plantas de al menos dos vectores diferentes, donde
(i) dichos al menos dos vectores diferentes son adaptados para que se recombinen entre sí mediante recombinación específica de sitio en dichas células vegetales con el fin de producir un producto de recombinación no replicante que contenga dicha secuencia de ADN de interés,
(ii) dichos al menos dos vectores diferentes son adaptados para que integren dicha secuencia de ADN de interés en dicho cromosoma,
(iii) dicha secuencia de ADN de interés contiene porciones de la secuencia de al menos dos de dichos al menos dos vectores diferentes, siendo dichas porciones de la secuencia necesarias para la expresión de dicha función de interés a partir de dicha secuencia de ADN de interés; y
(b) la selección de plantas o células vegetales que expresen dicha función de interés
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W04000892EP.
Solicitante: ICON GENETICS GMBH
ICON GENETICS, INC.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: BRIENNERSTRASSE 12A,80333 MUNCHEN.
Inventor/es: GLEBA,YURI, KLIMYUK,VICTOR, ELIBY,SERIK, GIRITCH,ANATOLY, MARILLONNET,SYLVESTRE.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 25 de Noviembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/82A4B
Clasificación PCT:
- A01H5/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- C12N15/82 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células vegetales.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Transformación de plantas mediante ensamblaje en vivo de una secuencia de interés.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un proceso para producir plantas transgénicas transformadas en un cromosoma. Además, la invención se refiere a un proceso para la selección de secuencias de nucleótidos para un fenotipo deseado en plantas. La invención se refiere también a plantas transgénicas y a bibliotecas de plantas o de semillas de plantas obtenidas u obtenibles de acuerdo con los procesos de la invención. Además, la invención se refiere a vectores para estos procesos y a plantas o células vegetales transformadas con los mismos.
Antecedentes de la invención
Los métodos utilizados actualmente para la transformación estable de plantas emplean normalmente la administración directa (bombardeo con microproyectiles, electroporación o tratamiento de protoplastos mediado por PEG, para una revisión ver: Gelvin, S.B., 1988, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; Hansen y Wright, 1999, Trends Plant Sci., 4, 226-231) o la administración mediada por Agrobacterium de fragmento(s) de ADN de interés premanipulado(s) a las células vegetales. Las manipulaciones con dichos vectores de ADN in planta están restringidas con el fin de simplificar la resolución de patrones de integración complejos (US6114600; Srivastava y Ow, 2001, Plant Mol. Biol., 46, 561-566; Srivastava y col., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11117-11121) o la eliminación de secuencias de ADN auxiliares de vectores integrados de manera estable en el ADN cromosómico. Los métodos de integración estable mediada por Agrobacterium de regiones de ADN-T en células vegetales utilizan el fragmento de ADN deseado completo flanqueado por secuencias limítrofes izquierda (LB) y derecha (RB) necesarias para la transferencia y la integración del ADN-T en el ADN cromosómico del huésped (US4940838; US5464763; EP0224287; US6051757; US5731179; WO9400977; EP0672752). En la mayoría de los casos, los procedimientos están dirigidos a la integración de una región específica de ADN-T en el ADN cromosómico. Se intentó también la cointegración de dos o más regiones de ADN-T diferentes (US4658082). Este último procedimiento se utiliza para segregar diferentes ADN-Ts en la progenie para fines diversos. Por ejemplo, Komari y colaboradores (US5731179) describen un método para transformar simultáneamente células vegetales con dos ADN-Ts, portando uno de ellos un marcador seleccionable funcional en plantas mientras que el otro ADN-T contiene un fragmento de ADN deseado para ser introducido en las células vegetales.
En general, las regiones de ADN diseñadas para integración estable en células vegetales son pre-construidas in vitro mediante el empleo de técnicas estándar de biología molecular (Sambrook, Fritsch y Maniatis, 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, NY: CSH Laboratory Press). Además, se utiliza la construcción in vivo en células bacterianas con el fin de, por ejemplo, ensamblar el vector binario con la ayuda de recombinación homóloga (US5731179). Las manipulaciones con ADN-T in planta están restringidas a regiones de ADN-T preintegradas en un cromosoma como es la eliminación de ciertas secuencias de ADN-T, por ejemplo secuencias que codifican marcadores seleccionables incluyendo genes que inducen una anormalidad morfológica. La eliminación de fragmentos de ADN no deseados de las regiones del ADN-T tiene lugar con la ayuda de recombinación específica de sitio (WO9742334; Endo y col., 2002, Plant J., 30, 115-122) o por medio de transposición (US5792924).
La recombinación específica de sitio ha sido utilizada para eliminar secuencias auxiliares de regiones de ADN-T. Aunque la escisión del ADN mediada por recombinasa/integrasa específica de sitio es más eficaz que la integración, es necesario realizar la selección por los acontecimientos de escisión, lo cual da lugar a una etapa adicional de cultivo de tejidos o de selección de la progenie por los acontecimientos de recombinación deseados. En resumen, todos los procesos de manipulación con ADN-Ts integrados de manera estable en los cromosomas vegetales son tediosos, inflexibles y en general están restringidos a una simple escisión (con menos eficacia que la integración) de los fragmentos de ADN deseados. Además, estos procesos están normalmente muy limitados en la diversidad combinatoria, ya que están restringidos a simples manipulaciones con un número limitado de genes y elementos reguladores conocidos.
Offringa y col. (EMBO J. (1990), 9, 3077-3084) han descrito un acontecimiento de recombinación homóloga extracromosómica entre dos ADN-Ts suministrados por Agrobacterium en células vegetales, seguido por la integración del producto de la recombinación en el ADN nuclear. La eficacia de recombinación homóloga extracromosómica entre los ADN-Ts coadministrados en la célula vegetal era sin embargo demasiado baja como para tener aplicaciones prácticas en la producción de vectores in vivo y se utilizó por tanto como un experimento control en estudios científicos del mecanismo de la recombinación homóloga en plantas (Offringa y col., 1990, EMBO J., 9, 3077-3084; Tinland y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8000-8004; Puchta y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 5055-5060). La frecuencia de recombinación homóloga seguida por la integración en el ADN cromosómico era del 1% aproximadamente de la frecuencia de cotransformación de la planta con dos ADN-Ts (Offringa y col., 1990, EMBO J., 9, 3077-3084; Tinland y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8000-8004; Puchta y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 5055-5060). Debido a la baja eficacia total de este proceso, no se han desarrollado aplicaciones prácticas de este método.
La frecuencia de integración vectorizada de ADN-T suministrado de manera transitoria a un sitio de IoxP preconstruido en plantas es también muy baja. Por ejemplo, Vergunst y colaboradores (1998, Nucl. Acids Res., 26, 2729-2734) demostraron que la frecuencia de integración específica de sitio mediada por Cre de un fragmento de ADN-T de interés suministrado por Agrobacterium en una región de ADN-T genómica con un sitio de IoxP está en el rango de 1,2-2,3% del número de acontecimientos de integración aleatorios. Debido a esta baja eficacia, tales procesos de integración requieren un ciclo adicional de selección y la utilización de cultivo de tejidos para recuperar las células portadoras de acontecimientos recombinantes. En contraste a esto, la frecuencia de re-ordenaciones de ADN cromosómico bicatenario con la ayuda de recombinasas específicas de sitio es significativamente más elevada y tiene lugar en el 29-100% de todas las células germinales de la planta (Zuo y col., 2001, Nature Biotechnol., 19, 157-161; Luo y col., Plant. J., 23, 423-430). Esto no es sorprendente, ya que las integrasas/recombinasas específicas de sitio requieren un sustrato de ADN bicatenario para el reconocimiento de los lugares de recombinación y la realización de la reacción de recombinación específica de sitio (Panigrahi y col., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 5927-5935; Martin y col., 2002, J. Mol. Biol., 19, 107-127; Thorpe y col., 2000, Mol. Microbiol., 38, 232-241).
Todos los datos mencionados anteriormente sugieren que el ADN-T suministrado transitoriamente a la célula vegetal es un mal sustrato para las recombinasas específicas de sitio.
En una invención previa, nosotros hemos resuelto la baja eficacia anteriormente descrita mediante el ensamblaje de ARN-amplicones víricos mediado por re-combinación específica de sitio (W002/088369). Los amplicones víricos ensamblados eran capaces de una potente amplificación autónoma, célula a célula y movimiento sistémico y, por tanto, podrían amplificar potentemente los acontecimientos de recombinación poco frecuentes. Tales amplicones víricos fueron ensamblados in planta a partir de dos o más vectores mediante recombinación específica de sitio mediada por recombinasa y contenían un gen de interés para ser expresado transitoriamente con el objetivo de conseguir la expresión más potente posible del gen de interés en una planta que había sido infectada por dichos vectores. Sin embargo, la expresión del gen de interés era transitoria; no se abordó la transformación estable de cromosomas vegetales para obtener una expresión...
Reivindicaciones:
1. Un proceso para producir plantas o células vegetales transgénicas transformadas de manera estable en un cromosoma con una secuencia de ADN de interés y capaces de expresar una función de interés a partir de dicha secuencia de ADN de interés, comprendiendo dicho proceso
- (a) la provisión a células vegetales o plantas de al menos dos vectores diferentes, donde
- (b) la selección de plantas o células vegetales que expresen dicha función de interés.
2. El proceso de la reivindicación 1, en el que dichos al menos dos vectores son proporcionados a dichas células vegetales mediante administración mediada por Agrobacterium.
3. El proceso de la reivindicación 2, en el que cada uno de dichos al menos dos vectores diferentes es proporcionado por una célula o cepa de Agrobacterium diferente.
4. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que uno o todos de dichos al menos dos vectores diferentes contiene(n) un gen autónomo de citoquinina funcional, mientras que dicha secuencia de ADN de interés carece de un gen autónomo de citoquinina funcional.
5. El proceso de la reivindicación 1, en el que dichos al menos dos vectores son proporcionados a dichas células vegetales mediante transferencia directa del ácido nucleico.
6. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa (a) comprende la provisión de una recombinasa específica de sitio específica para sitios de recombinación en dichos al menos dos vectores diferentes.
7. El proceso de la reivindicación 6, en el que dicha recombinasa específica de sitio es proporcionada mediante la inclusión de una secuencia expresable que codifique dicha recombinasa en un vector de dichos al menos dos vectores diferentes.
8. El proceso de la reivindicación 7, en el que la expresabilidad de dicha secuencia que codifica dicha recombinasa es destruida por dicha recombinación específica de sitio.
9. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho cromosoma es seleccionado del grupo siguiente: un cromosoma nuclear, un cromosoma plastídico o un cromosoma mitocondrial.
10. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichos al menos dos vectores diferentes son adaptados de tal manera que dicha secuencia de ADN de interés tenga secuencias limítrofes de ADN-T que faciliten la integración de dicha secuencia de ADN de interés en dicho cromosoma.
11. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichos al menos dos vectores diferentes son adaptados de tal manera que dicha secuencia de ADN de interés contenga secuencias de homología que faciliten la integración de dicha secuencia de ADN de interés en dicho cromosoma mediante recombinación homóloga.
12. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichos al menos dos vectores diferentes son adaptados para introducir dicha secuencia de ADN de interés en dicho cromosoma mediante integración específica de sitio.
13. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la etapa (b) comprende la selección de plantas o células vegetales que tengan dicha secuencia de ADN de interés integrada en dicho cromosoma.
14. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la etapa (b) comprende la selección de células o plantas en las cuales haya tenido lugar dicha recombinación específica de sitio entre dichos al menos dos vectores.
15. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dichos al menos dos vectores diferentes son adaptados de tal manera que dicha secuencia de ADN de interés contenga un gen marcador seleccionable o una secuencia que permita en la etapa (b) la selección de plantas o células vegetales transformadas que contengan dicha secuencia de ADN de interés.
16. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 15, en el que una porción de la secuencia de uno de dichos al menos dos vectores diferentes contiene un marcador seleccionable bajo el control traduccional de un elemento sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
17. El proceso de la reivindicación 16, en el que dicho marcador seleccionable no puede ser transcrito en dichas células vegetales a partir de uno de dichos al menos dos vectores diferentes, sino que es colocado por dicha recombinación específica de sitio bajo el control de elementos genéticos que permiten la transcripción de dicho marcador seleccionable.
18. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la etapa (b) comprende un proceso de selección por la ausencia de dichos al menos dos vectores diferentes y/o de productos de recombinación de los mismos, con la excepción de los productos de recombinación que contengan dicha secuencia de ADN de interés.
19. El proceso de la reivindicación 18, en el cual
- (a) al menos uno de dichos al menos dos vectores diferentes o
- (b) los productos de recombinación de dicha recombinación específica de sitio que no contienen dicha secuencia de ADN de interés
contienen un gen marcador contraseleccionable u otra secuencia que permita la selección frente a las células transformadas que contienen dichos vectores según se definió en (a) o dichos productos de recombinación según se definió en (b).
20. El proceso de la reivindicación 19, en el que dicho gen marcador contraseleccionable o dicha otra secuencia que permite la selección frente a las células transformadas que contienen dichos vectores, está bajo el control traduccional de un elemento sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
21. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha expresión de dicha función de interés a partir de dicha secuencia de ADN de interés comprende ayuste en cis mediado por un intrón.
22. El proceso de la reivindicación 21, en el cual
- - un primer vector de dichos al menos dos vectores diferentes contiene una primera porción de la secuencia que contiene:
- - un segundo vector de dichos al menos dos vectores diferentes contiene una segunda porción de la secuencia que contiene:
23. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 22, en el que se proporcionan tres o más vectores diferentes a dicha planta o a dichas células vegetales en la etapa (a) y se producen dos o más plantas o células vegetales transgénicas diferentes, teniendo dichas plantas o células vegetales transgénicas diferentes secuencias de ADN de interés diferentes integradas en un cromosoma.
24. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 22, en el que se proporcionan a dichas células vegetales dos vectores diferentes y dicha secuencia de ADN de interés contiene una porción de la secuencia de cada uno de estos dos vectores.
25. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende las etapas (A) y (B) siguientes:
- (A) el suministro a plantas o células vegetales de una mezcla de
- (B) la selección de las plantas o células vegetales transformadas que expresen una función de interés a partir de una secuencia de ADN de interés.
26. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 23 ó 25, que comprende las etapas (A) y (B) siguientes:
- (A) el suministro a plantas o células vegetales de una mezcla de
- (B) la selección de las plantas o células vegetales transformadas que expresen una función de interés a partir de una secuencia de ADN de interés.
27. El proceso de la reivindicación 25 ó 26, que comprende además la determinación de una característica fenotípica de una planta o una célula vegetal transformada seleccionada en la etapa (B) debido a una función de
una porción de secuencia primaria y/o
una porción de secuencia secundaria y/o
una combinación de una porción de secuencia primaria y una porción de secuencia secundaria.
28. Plantas transgénicas o partes de las mismas como semillas transformadas en un cromosoma con una secuencia de ADN de interés y capaces de expresar una función de interés a partir de dicha secuencia de ADN de interés,
conteniendo dicha secuencia de ADN de interés:
- - una primera porción de secuencia que contiene una primera parte de una secuencia que codifica la función que va a ser expresada y, corriente abajo de la misma, la parte 5' de un intrón, y
- - una segunda porción de secuencia que contiene una segunda parte de una secuencia que codifica una función que va a ser expresada y, corriente arriba de la misma, la parte 3' de un intrón,
siendo dicha planta transgénica o dichas partes de la misma producibles mediante el proceso de la reivindicación 22 y comprendiendo la expresión de dicha función de interés a partir de dicha secuencia de ADN de interés un ayuste en cis mediado por un intrón.
29. Las plantas transgénicas o partes de las mismas como semillas de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicha secuencia de ADN contiene, entre dichas porciones de secuencias, un sitio de recombinación específica de sitio o una región resultante de la recombinación específica de sitio entre sitios de recombinación específica de sitio.
30. Las plantas transgénicas o partes de las mismas como semillas de acuerdo con la reivindicación 29, donde dicho sitio de recombinación específica de sitio o dicho sitio resultante de recombinación específica de sitio entre los sitios de recombinación específica de sitio es seleccionado de IoxP, attR, attL.
31. Las plantas transgénicas o partes de las mismas como las semillas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en las que dicha secuencia de interés contiene secuencias limítrofes del ADN-T
32. Las plantas transgénicas o partes de las mismas de acuerdo con la reivindicación 28, en las que todas las secuencias codificadoras y/o las secuencias expresables de dicha secuencia de interés son de origen vegetal.
33. Utilización de una planta o de células vegetales transgénicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32 para generar una segunda planta transgénica o segundas células vegetales transgénicas conteniendo ADN extracromosómico, donde dicha generación comprende: la inducción de la formación de dicho ADN extracromosómico a partir de dicha secuencia de ADN de interés integrada en la planta o en las células vegetales transgénicas de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32.
34. Utilización de acuerdo con la reivindicación 33, en la que dicha inducción comprende el suministro de un factor a dichas plantas o células vegetales transgénicas, en las que dicho factor puede desencadenar la formación de dicho ADN extracromosómico a partir de dicha secuencia de ADN de interés.
35. Utilización de acuerdo con la reivindicación 34, en la que dicho suministro de dicho factor comprende el cruce de dicha planta o de dichas células vegetales con una planta o con células vegetales que tengan codificado dicho factor en su genoma.
36. Una biblioteca de plantas o de semillas de plantas obtenidas u obtenibles de acuerdo con una de las reivindicaciones 25 a 27.
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