TRANSFECCION DE ORGANULOS MEDIADA POR UN VECTOR.

Un método para transfectar orgánulos de células eucariotas, comprendiendo dicho método la etapa de introducir un vector viral recombinante en el citosol de una célula eucariota,

uniéndose el vector viral recombinante específicamente a un receptor localizado únicamente en la superficie del orgánulo que se va a transfectar y siendo dichos orgánulos de células eucariotas mitocondrias o cloroplastos, y en el que (i) dicho método se lleva a cabo in vitro y/o (ii) dicha célula eucariota es una célula vegetal

Transfección de orgánulos mediada por un vector.

Derechos del Gobierno de los Estados Unidos

Esta invención se realizó con apoyo del Gobierno de los Estados Unidos bajo la Subvención Nº NIH NS 39005 y NIH NS39788 concedida por los Institutos Nacionales de la Salud. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de acuerdo con 35 U.S.C.119(e) respecto a la solicitud de atente provisional Nº 60/340.338 presentada el 13 de diciembre de 2001.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y métodos de transfección de orgánulos, en particular mitocondrias y cloroplastos.

Antecedentes de la invención

Las mitocondrias son los únicos orgánulos productores de energía en todas las células eucariotas y, por lo tanto, desempeñan un papel crítico en el mantenimiento de una bioenergética celular, niveles homeostáticos y ciclos vitales celulares apropiados. De forma similar, los cloroplastos también son máquinas productoras de ATP eficaces que usan la luz como fuente de energía en lugar de azúcares o ácidos grasos. Tanto las mitocondrias como los cloroplastos contienen múltiples copias de ADN de orgánulos que se replica y se transcribe en los orgánulos. En mamíferos, el ADN mitocondrial (ADNmt) es un genoma circular sin intrones de aproximadamente 10,6 kilobases que codifica 13 proteínas de la cadena de transporte de electrones (ETC), 2 ARN ribosómicos y 22 ARNt. La mayoría de las percepciones de la genética mitocondrial han venido de levaduras, en las que la transformación biolística permite la modificación por ingeniería genética de replicones mitocondriales. Sin embargo, muchas características de la expresión de genes mitocondriales y de la biogénesis de la cadena respiratoria de mamíferos no son reproducibles en levaduras.

En mamíferos, la fusión citoplasmática y la microinyección se usan para introducir mitocondrias de donante, pero estas técnicas no proporcionan un mecanismo para la manipulación directa del ADNmt. Además, se ha descrito la captación de ADN exógeno en mitocondrias implicando a la ruta de importación de proteínas por dos laboratorios. Vestweber y Schatz ([1991] Nature (Londres) 338: 170-172) lograron la captación de un oligonucleótido tanto mono- como bicatenario de 24 pb en mitocondrias de levaduras por acoplamiento del extremo 5' del oligonucleótido con una proteína precursora que consiste en la presecuencia de la subunidad IV de la citocromo c oxidasa de levadura fusionada a una dihidrofolato reductasa de ratón modificada. Más recientemente, Seibel et al. (1995, Nucleic Acids Research 23: 10-17) describieron la importación en la matriz mitocondrial de moléculas de ADN bicatenario conjugadas con el péptido líder amino-terminal de la ornitina transcarbamilasa de rata. Sin embargo, ambos estudios se realizaron con mitocondrias aisladas, sin abordar la cuestión de cómo los conjugados de oligonucleótido-péptido atravesarán la membrana citosólica y alcanzarán la proximidad de la mitocondria.

La patente de Estados Unidos Nº 6.171.863 describe el uso de complejos de decualinio-ADN como vehículo para suministrar ADN al interior de células y, potencialmente, en las mitocondrias. Debido a que el ADN se asocia con decualinio, el complejo resultante tiene una carga positiva. El complejo cargado positivamente es atraído hacia compartimentos cargados negativamente. Por lo tanto, la patente de Estados Unidos Nº 6.171.863 describe el suministro de ADN a compartimientos cargados negativamente, y no describe el suministro específico de ADN a mitocondrias o cloroplastos. De hecho, no se ha descrito ninguna técnica para dirigirse a orgánulos específicos, por ejemplo, el cloroplasto o la mitocondria, para el suministro de ácidos nucleicos usando un mecanismo de receptor:ligando.

Por lo tanto, la incapacidad para manipular específicamente el genoma de cloroplastos y mitocondrias ha obstaculizado los esfuerzos de los investigadores por entender completamente el cloroplasto y los procesos de replicación, transcripción y traducción de ADNmt. La capacidad para manipular específicamente ADNmt e introducirlo en células vivas aumentaría enormemente la capacidad de los investigadores para investigar completamente la función de genes cloroplásticos/mitocondriales individuales y la función global de cloroplastos/mitocondrias.

Además, la capacidad para manipular el genoma mitocondrial también proporciona un nuevo método de tratamiento de enfermedades asociadas con una función mitocondrial defectuosa. Con la edad, la función de las mitocondrias disminuye, con un aumento marcado de mutaciones y grandes deleciones de ADNmt. En particular, los daños oxidativos aumentan con la edad, conduciendo con frecuencia a una mayor tasa de mutaciones de ADNmt. Aparte de las mutaciones de ADNmt conocidas, varias formas de cáncer y neurodegeneración se asocian con mutaciones en el ADNmt. Por ejemplo, las mutaciones en el ADN mitocondrial son la causa que se sospecha de un hospedador de enfermedades neurológicas degenerativas incluyendo Alzheimer, Parkinson y diabetes de comienzo en adultos. Estas mutaciones dan como resultado una disminución en la eficacia de la cadena de transporte de electrones y la acumulación de deleciones de ADNmt debido a daños por radicales libres (envejecimiento).

Además, dadas las funciones bioenergéticas de los cloroplastos, la capacidad para introducir genes exógenos o manipular de otro modo el genoma de cloroplastos podría tener un impacto tremendo sobre el aumento de la vitalidad y los rendimientos de cultivos y otras plantas. Por ejemplo, la introducción de genes en cloroplastos puede conducir a plantas con una viabilidad aumentada en entornos de otro modo hostiles y a una eficacia de fotosíntesis aumentada. Además, se piensa que la expresión de genes exógenos dentro de los cloroplastos es significativamente más eficaz en los cloroplastos respecto a la expresión de genes exógenos introducidos en el núcleo de la célula. Por lo tanto, la transfección de cloroplastos puede permitir estrategias de biosíntesis más eficaces para compuestos comerciales.

Filogenéticamente, las mitocondrias y cloroplastos se parecen a las primeras bacterias. Y así, los solicitantes reconocieron que podían utilizarse potencialmente virus bacterianos (por ejemplo, bacteriófago lambda) para introducir ADN en estos orgánulos de animales y plantas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones, métodos y sistemas para introducir secuencias de ácido nucleico en un orgánulo de una célula eucariota intacta, siendo dichos orgánulos mitocondrias o cloroplastos. Un aspecto de la presente invención proporciona construcciones de ácidos nucleicos y procedimientos para suministrar ácidos nucleicos a orgánulos específicos usando una estrategia de receptor:ligando, siendo dichos orgánulos mitocondrias o cloroplastos. Típicamente, los orgánulos a los que se dirigen expresan un receptor que se une a un ácido nucleico o vector de ácido nucleico. Por consiguiente, se describen en este documento métodos y composiciones para transfectar orgánulos de células eucariotas mediante el uso de un vector, por ejemplo, un vector viral, que comprende una proteína receptora/de acoplamiento. Los vectores virales y receptores adecuados incluyen, pero sin limitación, un vector viral bacteriano tal como el bacteriófago lambda.

Se describe un sistema que comprende una célula viable intacta que comprende uno o más orgánulos modificados y un vector recombinante, siendo dichos orgánulos mitocondrias o cloroplastos.

Los orgánulos modificados comprenden uno o más receptores localizados en la superficie del orgánulo y el vector recombinante se selecciona basándose en su capacidad para unirse específicamente al receptor localizado en el orgánulo modificado.

También se describen métodos de corrección de defectos genéticos, aumento de la expresión de ácidos nucleicos específicos, interferencia con la expresión de ácidos nucleicos específicos, restauración o aumento de la función de orgánulos, aumento de la biosíntesis de ácidos nucleicos específicos y sus proteínas correspondientes usando suministro dirigido de ácidos nucleicos a orgánulos o compartimentos celulares específicos, siendo dichos orgánulos mitocondrias o cloroplastos. Otros aspectos se refieren a minimizar o reducir la progresión de enfermedades, aliviar síntomas y ajustar el metabolismo celular. Particularmente, la invención se refiere...

1. Un método para transfectar orgánulos de células eucariotas, comprendiendo dicho método la etapa de introducir un vector viral recombinante en el citosol de una célula eucariota, uniéndose el vector viral recombinante específicamente a un receptor localizado únicamente en la superficie del orgánulo que se va a transfectar y siendo dichos orgánulos de células eucariotas mitocondrias o cloroplastos, y en el que (i) dicho método se lleva a cabo in vitro y/o (ii) dicha célula eucariota es una célula vegetal.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método comprende las etapas de proporcionar una célula que comprende un orgánulo modificado, comprendiendo dicho orgánulo modificado un receptor viral; e introducir un vector viral recombinante en el citosol de dicha célula que contiene un orgánulo modificado para producir un orgánulo transfectado.

3. Un sistema para transfectar mitocondrias o cloroplastos de células eucariotas, comprendiendo dicho sistema:

una construcción de ácido nucleico, comprendiendo dicha construcción una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de localización en orgánulos unido operativamente a un receptor viral; y

un vector viral recombinante.

4. El método o sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho vector viral es un vector de bacteriófago y dicho receptor es un receptor de bacteriófago.

5. El método o sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el vector viral recombinante es bacteriófago lambda y el receptor es un receptor de lambda.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 ó 5, en el que el vector viral recombinante se introduce en el citosol celular por electroporación, microinyección, precipitación con calcio, fusión o por tratamiento químico.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el tratamiento químico comprende poner en contacto la célula con lípidos catiónicos.

8. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de localización mitocondrial o cloroplástica unida operativamente a una secuencia que codifica un receptor viral.

9. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en el que el receptor viral se selecciona del grupo constituido por OmpF, OmpC, PhoE y lamB.

10. Una célula eucariota que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 8 ó 9.

11. Una célula eucariota que comprende una mitocondria o cloroplasto modificado, comprendiendo dicha mitocondria o cloroplasto modificado un receptor de bacteriófago lambda localizado en su membrana externa.

12. Un método para preparar una célula que tenga una mitocondria o cloroplasto modificado, comprendiendo dicho método la etapa de transfectar dicha célula con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una señal de localización mitocondrial o cloroplástica unida operativamente a un receptor de bacteriófago lambda, en el que (i) dicho método se realiza in vitro y/o (ii) dicha célula es una célula vegetal.

13. El método o sistema de la reivindicación 12, o la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 8 ó 9, en el que la señal de localización en orgánulos es una señal de localización mitocondrial que es la subunidad VIII de la citocromo oxidasa humana.

14. Un polipéptido que comprende una señal de localización mitocondrial unida operativamente a un receptor de bacteriófago lambda.

15. Una composición que comprende un péptido señal de localización mitocondrial unido operativamente a un ácido nucleico que codifica un receptor de bacteriófago lambda.

16. Un kit para transfectar mitocondrias o cloroplastos de células eucariotas, comprendiendo dicho kit:

(i) una construcción de ácido nucleico, comprendiendo dicha construcción comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de localización mitocondrial o cloroplástica unida operativamente a un receptor viral; o

(ii) una célula eucariota que comprende una mitocondria o cloroplasto que tiene un receptor viral en la superficie de dicha mitocondria o cloroplasto; y

(iii) componentes de empaquetamiento de virus para preparar un vector viral recombinante.

17. El kit de la reivindicación 16, en el que el receptor viral y el vector viral son como se han definido en la reivindicación 4 o reivindicación 5.

18. El kit de la reivindicación 16, en el que la señal de localización es la subunidad VIII de la citocromo oxidasa humana.

19. Un orgánulo, estando dicho orgánulo transfectado para que exprese un receptor específico para un vector recombinante y siendo dicho orgánulo una mitocondria o un cloroplasto.

20. El orgánulo de la reivindicación 19, en el que el receptor se selecciona del grupo que consiste en OmpF, OmpC, Phoe y lamB.

21. El orgánulo de la reivindicación 19, en el que el receptor se expresa en la membrana externa del orgánulo.

22. El orgánulo de la reivindicación 19, en el que el vector recombinante comprende bacteriófago lambda.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, para modificar el metabolismo de una célula eucariota, comprendiendo el método

modificar la mitocondria de una célula eucariota que comprende una mitocondria que tiene al menos un componente de la cadena respiratoria defectuoso; para que presente un receptor de vector en la membrana externa de la mitocondria; e

introducir un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un componente de la cadena respiratoria funcional en el citosol de la célula eucariota, compensando el componente de la cadena respiratoria funcional al menos un componente de la cadena respiratoria defectuoso, y

en el que el vector recombinante se une al receptor de vector y suministra el ácido nucleico a la mitocondria.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, para restaurar o aumentar la actividad citocromo oxidasa en una célula, comprendiendo el método

transfectar una mitocondria de una célula hospedadora para que exprese un receptor, e

introducir un vector que se una específicamente al receptor en la célula hospedadora, comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica una subunidad de citocromo oxidasa.

25. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, para compensar una mutación de ADNmt, comprendiendo el método las etapas de transfectar una mitocondria de una célula hospedadora que comprende una mutación de ADNmt obtenida de un hospedador que tiene dicha mutación de ADNmt para que exprese un receptor y

introducir un vector que se una específicamente al receptor en la célula hospedadora, comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica un producto funcional que se corresponde con la mutación de ADNmt.

26. Un animal transgénico no humano que contiene mitocondrias transfectadas preparadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.