SOLUCIONES DE COENZIMAS ESTABILIZADAS Y SU USO PARA LA DETERMINACION DE DESHIDROGENASAS O BIEN SUS SUSTRATOS.

Solución acuosa estabilizada de un coenzima para enzimas transmisores de hidrógeno,

que se caracteriza por que la solución de NAD, NADP o de un derivado correspondiente en forma oxidada o reducida así como de uno o varios compuestos orgánicos o sales correspondientes consta de un valor pKa entre 1,5 y 6,0 y de ácido cítrico o de sal de citrato y de un compuesto de nitrógeno de fórmula general (I)

Soluciones de coenzimas estabilizadas y su uso para la determinación de deshidrogenasas o bien sus sustratos.

La invención se refiere a soluciones acuosas estabilizadas de un coenzima para enzimas que llevan hidrógeno así como a su utilización para determinar un analito correspondiente (sustrato) en forma reducida o a la actividad enzimática de una deshidrogenasa correspondiente. La solución estabilizada contiene un compuesto orgánico o las sales respectivas con un valor de pKa entre 1,5 y 6,0 y/o un derivado de hidroxilamina.

La determinación de las actividades enzimáticas (o de las concentraciones de sustrato), en particular en suero sanguíneo o en plasma tiene un importante papel en el diagnóstico clínico químico. Frecuentemente se emplean para ello métodos analíticos que se basan en la reducción de la Nicotinamida-adenin-dinucleótido ("NAD") o bien Nicotinamida-adenin-dinucleótido-fosfato ("NADP") y en el registro fotométrico del cambio que ha tenido lugar en el comportamiento de la absorción en el campo de longitudes de onda ultravioleta (?=334, 340 o 365 nm). Al elegir las condiciones de prueba adecuadas este cambio es linealmente proporcional a la actividad enzimática que se va a determinar (o bien a la concentración de sustrato).

Para determinar la actividad enzimática de la lactatodeshidrogensasa (LDH, E.C.1.1.1.127) se recomienda hoy en día el método descrito en Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 31, 897 (1994) y Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 32, 639 (1994). El principio de análisis prevé la oxidación de lactato a piruvato bajo la reducción simultánea de un coenzima como el NAD o NADP a NADH o NADPH. Dicha reacción - como aquí por ejemplo la catalizada por LDH - tiene lugar en un medio alcalino (pH 9,4). Esta inestabilidad se exterioriza en un aumento moderadamente rápido de la extinción (del llamado valor blanco reactivo), en un margen de longitudes de onda correspondiente a la medición, de manera que transcurrido poco tiempo (3 meses) incluso en el almacenamiento en frío (2 hasta 8ºC) la combinación de reactivos es inútil. Este problema se plantea en especial para la fabricación de reactivos líquidos estables durante largo tiempo, preparados para el uso, que deben facilitar al usuario una realización a ser posible segura y simple de los análisis en la rutina diaria.

De la JP 84/82398 se conoce un método para la estabilización de coenzimas acuosos, utilizando formadores de quelatos y azidas. Sin embargo, el inconveniente de este método es que se requiere la adición de azida y el anión azida se ha clasificado como cancerígeno en la actualidad y además tiene un efecto inhibidor de muchas enzimas.

Se sabe además como estabilizar soluciones de coenzimas mediante la adición de sales de metales pesados, por ejemplo, en forma de iones de cobre (II) y de este modo contrarrestar un incremento del valor del blanco de reactivos (DE 195 43 493 o bien EP 0 804 610) Para un periodo de almacenamiento más largo o bien para temperaturas de almacenamiento superiores (incluso a partir de 10ºC) se pueden formar productos de degradación que inhiban la enzima deshidrogenasa que se va a determinar y por tanto produzcan valores de medición inferiores. Un reactivo estabilizable durante un periodo de tiempo largo (3 y más meses) con una calidad uniforme, donde entre otras cosas se puedan evitar las calibraciones reiteradas, no se encuentra disponible en la actualidad.

La presente invención tiene por tanto el cometido de conseguir un reactivo líquido estable mejorado que presente un coenzima para enzimas transmisores de hidrógeno, que sea adecuado para la determinación de la actividad de la deshidrogenasa o del sustrato correspondiente.

El cometido se resuelve mediante una solución acuosa conforme a la reivindicación 1. Como grupos alquilo son especialmente adecuados aquellos radicales que presentan uno hasta diez átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden ser de cadena lineal o ramificada. Los grupos arilo pueden ser grupos fenilo sustituidos o no sustituidos, si fuera preciso enlazados por un grupo alquenilo, que puede presentan uno hasta 8 átomos de carbono. En particular son especialmente adecuados los compuestos de nitrógeno de la fórmula (I) ya conocida, es decir, derivados de hidroxilamina como la hidroxilamina, O- o N-alquilhidroxilamina con uno hasta seis átomos de carbono o bien la O-benzilhidroxilamina y las sales derivadas de la misma, como por ejemplo, sulfatos, fosfatos o sales de amonio. Los derivados de hidroxilamina correspondientes se caracterizan además por una acción complejante frente a los productos de degradación del coenzima.

La estabilidad de las soluciones se puede mejorar además cuando se añade un formador de complejos, es decir un ligando, que presenta dos o más puntos o lugares de coordinación. Pueden darse ligandos bidentados, como por ejemplo la etilendiamina y ligandos polidentados, como la etilendiamina-N, N, N, el ácido tetraacético (EDTA) o las sales correspondientes, en particular la sal disódica, el éter corona o los criptandos. Lo que equivale a una concentración del formador de complejos de aproximadamente 0,5 hasta 30 mM, preferiblemente 1,0 hasta 5,0 mM.

Los compuestos orgánicos adicionados conforme a la invención o las sales derivadas de los mismos con un valor de pKa entre 1,5 y 6,0 son aquellos ácidos orgánicos, que disponen de más de un efecto complejante y una acción amortiguadora en el margen de pH entre 1,0 y 7,0, como el ácido cítrico y las sales solubles en agua derivadas del mismo.

Las concentraciones de los compuestos orgánicos, sales o derivados de hidroxilamina adicionados pueden variar en límites amplios, es decir entre 0,001 y 1,0 M. Una concentración de aprox. 5 hasta 200 mM para el ácido cítrico o el citrato puede ser especialmente adecuada. En numerosos casos concentraciones de aprox. 50 mM de ácido cítrico o citrato producían el efecto deseado. El margen de concentración preferido para el derivado de hidroxilamina que se ha añadido conforme a la invención en presencia de un compuesto orgánico con un valor de pKa correspondiente se sitúa entre 2 y 300 mM. El valor del pH de la solución acuosa estabilizada puede oscilar entre 1,0 y 7,0, de forma que el valor del pH se ha comprobado que preferiblemente se encuentra entre 2,0 y 4,0 o bien alrededor de 3,0.

Se ha comprobado que lo más preferible es que un derivado de hidroxilamina al que se ha añadido una sal de citrato se encuentren en un reactivo que contiene NAD o NADP y si fuera preciso, en otro reactivo que contenga un analito transmisor de hidrógeno, que contenga además sustratos y sustancias auxiliares, además de ácido bórico o una sal de borato, para la determinación del tampón correspondiente, como por ejemplo, N-metilglucamina (MEG). Para esta configuración sirven también los datos de concentración ya indicados. Además se ha comprobado que se prefieren aprox. 20 hasta 200 mM de citrato o ácido cítrico y aprox. 10 hasta 150 mM del derivado de hidroxilamina correspondiente. Para el derivado de ácido bórico que se ha añadido a la solución de sustrato que no contiene NAD/NADP (llamado reactivo 1) se ha comprobado que lo apropiado es un margen de concentración entre 50 y 200 mM.

Como tampón son adecuadas aquellas sustancias para el reactivo que contiene el sustrato, que presentan una buena capacidad amortiguadora entre un pH de 8,5 y 10,0, como por ejemplo, los llamados buenos tampones (tricina, bicina, TAPS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS), carbonatos de iones de metales alcalinos, MEG, TRIS así como tampón fosfato. También se ha comprobado que las mezclas de las llamadas sustancias tampón son muy adecuadas. Lo preferido es que la concentración tampón oscile entre 10 y 1000 mM, preferiblemente entre 200 y 600 mM. En la solución tampón alcalina (reactivo 1), que fija el valor del pH de trabajo se ha comprobado que lo preferible es la adición de ácido bórico o de sus sales y derivados solubles. La concentración de los componentes de ácido bórico correspondiente se sitúa entre 50 y 200 mM, preferiblemente alrededor de 100 mM.

Como coenzimas en el sentido de la presente invención se tienen en cuenta el NAD o el NADP, pero también los coenzimas modificados, como por ejemplo tioNAD(P) o NHxDP (= nicotinamidahipoxantina-dinucleótidofosfato). Los coenzimas pueden presentarse en una concentración de aproximadamente 1,0 hasta 100 mM en la cubeta de reacción, preferiblemente en un margen de 5,0 hasta 15,0 mM.

Las soluciones de coenzimas estabilizadas conforme a la invención se emplean en forma de soluciones acuosas. El reactivo preparado para ello es...

1. Solución acuosa estabilizada de un coenzima para enzimas transmisores de hidrógeno, que se caracteriza por que la solución de NAD, NADP o de un derivado correspondiente en forma oxidada o reducida así como de uno o varios compuestos orgánicos o sales correspondientes consta de un valor pKa entre 1,5 y 6,0 y de ácido cítrico o de sal de citrato y de un compuesto de nitrógeno de fórmula general (I)

donde el radical R¹ es hidrógeno, un grupo alquilo o arilo saturado o insaturado y los radicales R² =R³ = H.

2. Solución estabilizada conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza por, que como compuesto orgánico contiene un ácido o una sal correspondiente con un efecto amortiguador en el margen de pH de 1,0 hasta 7,0.

3. Solución estabilizada conforme a la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza por, que contiene aproximadamente 5 hasta 500 mM de ácido cítrico o sal de citrato.

4. Solución estabilizada conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 3, que se caracteriza por, que el valor del pH de la solución se encuentra entre 1,0 y 7,0.

5. Solución estabilizada conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 4, que contiene un hidroxilo-, O- o N-alquilhidroxil-, O-benzilhidroxilamina.

6. Solución estabilizada conforme a la reivindicación 5, que se caracteriza por, que contiene un derivado de hidroxilamina en una concentración entre 2 y 300 mM.

7. Método para la determinación de un analito transmisor de hidrógeno o de una deshidrogenasa en presencia de un coenzima que absorbe hidrógeno, que se caracteriza por que el coenzima se encuentra en una solución acuosa estabilizada conforme a las reivindicaciones 1 hasta 6.

8. Método para la determinación conforme a la reivindicación 7, que se caracteriza por que el analito lactato, glutamato, amoníaco, alcohol, glicerinaldehido-3-fosfato o glucosa se determina en presencia de un lactato-, glutamato-, alcohol-, glicerina-3-fosfato o glucosa-deshidrogenasa.

9. Método conforme a una de las reivindicaciones 7 ó 8, que se caracteriza por que el valor del pH se sitúa entre 8,5 y 10,0 y la concentración final de la sal de citrato y/o del derivado de hidroxilamina se sitúa entre 2 y 50 mM.

10. Kit o equipo para la determinación de un analito transmisor de hidrógeno en una muestra que consta de los siguientes componentes:

- un primer reactivo, que contiene una deshidrogenasa en un sistema tamponado a un pH adecuado entre 8,5 y 10,0, y

- un segundo reactivo conforme a la reivindicación 1, que contiene un coenzima para un enzima transmisor de hidrógeno y un compuesto orgánico con un valor pKa entre 1,5 y 6,0 y ácido cítrico o sal de citrato y un compuesto de nitrógeno de fórmula general (I)

donde el radical R¹ es hidrógeno, un grupo alquilo o arilo saturado o insaturado y los radicales R² =R³ = H.

11. Kit o equipo para la determinación de la actividad enzimática de una deshidrogenasa en una muestra que consta de los siguientes componentes:

- un primer reactivo, que contiene un analito transmisor de hidrógeno en un sistema tamponado a un pH adecuado entre 8,5 y 10,0, y

- un segundo reactivo conforme a la reivindicación 1, que contiene un coenzima para un enzima transmisor de hidrógeno y un compuesto orgánico con un valor de pKa entre 2,0 y 4,0 y ácido cítrico o sal de citrato y un derivado de hidroxilamina de fórmula general (I) conforme a la reivindicación 10.

12. Kit o equipo conforme a una de las reivindicaciones 10 ó 11, que se caracteriza por que el segundo reactivo contiene ácido cítrico, una sal de citrato y un derivado de hidroxilamina.

13. Kit o equipo conforme a las reivindicaciones 10 hasta 12, que se caracteriza por que el segundo reactivo presenta un valor de pH entre 1,0 y 7,0.

14. Kit o equipo conforme a una de las reivindicaciones 10 hasta 13, que se caracteriza por que el segundo reactivo presenta un valor de pH de aproximadamente 3,0.

15. Kit o equipo conforme a una de las reivindicaciones 10 hasta 14, que se caracteriza por que contiene aproximadamente de 5 hasta 200 mM de una sal de citrato y/o 2 hasta 300 mM de un derivado de hidroxilamina en un primero o segundo reactivo.