Mutantes termoestables de la glucosa deshidrogenasa dependiente de quinona de pirroloquinolina.

Proteína mutante de s-GDH dependiente de QPQ caracterizada por que en por lo menos una de las posiciones 122 y 124 se encuentra presente el aminoácido lisina,

en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones aminoácidas conocidas de la GDH de secuencia de tipo salvaje de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2, en la que dicho mutante presenta una mayor estabilidad que la proteína que no presenta dichas sustituciones y en la que dicha proteína es por lo menos 90% idéntica a SEC ID nº 2.

Mutantes termoestables de la glucosa deshldrogenasa dependiente de quinona de pirroloquinolina

La presente Invención se refiere a una proteína muíante de s-GDH dependiente de QPQ caracterizada porque en por lo menos una de las posiciones 122 y 124 se encuentra presente el aminoácido Usina, en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones aminoácidas conocidas de la GDH de secuencia de tipo salvaje de A. calcoaceticus (SEC ID n° 2); también da a conocer genes codificantes de dicha s-GDH muíante, y diferentes aplicaciones de dichos mutantes de s-GDH, particularmente para determinar la concentración de glucosa en una muestra.

Campo de la invención:

La determinación de la concentración de glucosa sanguínea resulta extremadamente importante en el diagnóstico clínico y en el control de la diabetes. Aproximadamente 150 millones de personas en todo el mundo sufren la enfermedad crónica de la diabetes mellitus, un número que podría doblarse para el 2025 según la OMS. Aunque la diabetes se diagnóstica y trata con facilidad, un control de largo plazo exitoso requiere herramientas diagnósticas de bajo coste que informen rápida y exactamente de las concentraciones de glucosa en sangre. Las glucosa deshidrogenasas dependientes de QPQ (EC 1.1.5.2) catalizan una reacción en la que se oxida la glucosa en gluconolacona. En consecuencia, se utiliza este tipo de enzima en la medición del azúcar en sangre. Una de dichas herramientas es una tira diagnóstica basada en la glucosa deshidrogenasa soluble (s-GlucDOR, EC 1.1.5.2), un enzima que contiene quinona de pirroliquinolina originalmente derivada de Acinetobacter calcoaceticus.

Las quinoproteínas utilizan quinona como cofactor para oxidar alcoholes, aminas y aldosas en sus lactonas, aldehidos y ácidos aldólicos correspondientes (Duine J.A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter, en: "The Biology of Acinetobacter", 295 a 312, New York, Plenum Press, 1991; Duine J.A., Eur. J. Biochem. 200:271-284, 1991; Davidson V.L., en: "Principies and applications of quinoproteins", el libro completo, New York, Marcel Dekker, 1993; Anthony C., Biochem. J. 320:697-711, 1996; Anthony C. y Ghosh M., Current Science 72:716-727, 1997; Anthony C., Biochem. Soc. Trans. 26:413-417, 1998; Anthony C. y Ghosh M., Prog. Biophys. Mol. Biol. 69:1-21, 1998. Entre las quinoproteínas, aquéllas que contienen el cofactor no unido covalentemente 2,7,9-tricarboxi-1H-pirrolo[2,3-f]quinolín-4,5-diona (QPQ) constituye el subgrupo más grande (Duine, 1991, supra). Todas las quinona glucosa deshidrogenasas bacterianas conocidas hasta el momento pertenecen a dicho subgrupo con QPQ como cofactor (Anthony y Ghosh, supra, 1997; Goodwin P.M. y Anthony C., Adv. Microbiol. Physiol. 40:1-80, 1998; Anthony C., Adv. in Phot. and Resp. 15:203-225, 2004).

Se han caracterizado dos tipos de glucosa deshidrogenasa dependiente de QPQ (EC 1.1.5.2) en bacterias: una se encuentra unida a membrana (m-GDH); la otra es soluble (s-GDH). Ambos tipos no comparten ninguna homología significativa de secuencia (Cleton-Jansen A.M. et al., Mol. Gen. Genet. 217:430-436, 1989; Cleton-Jansen A.M. et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56:73-79, 1989; Oubrie A. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 96:11787-11791, 1999). También son diferentes con respecto a tanto sus propiedades cinéticas como a sus propiedades inmunológicas (Matshushita K. et al., Bioscience Biotechnol. Biochem. 59:1548-1555, 1995). Las m-GDH son comunes en las bacterias Gram-negativas; sin embargo, las s-GDH se han encontrado únicamente en el espacio periplasmático de las cepas de Acinetobacter, tales como A. calcoaceticus (Duine J.A. 1991a; Cleton-Jansen A.M. et al., J. Bacteriol. 170:2121-2125, 1988; Matsushita y Adachi, 1993) y A. baumannii (patente JP n° 11243949).

Mediante la búsqueda de bases de datos de secuencias, se han identificado dos secuencias homologas de la s- GDH de A. calcoaceticus de longitud completa en E. coli K-12 y en Synechocystis sp. Además, también se han encontrado dos secuencias incompletas homologas de la s-GDH de A. calcoaceticus en el genoma de P. aeruginosa y de Bordetella pertussis (Oubrie et al., 1.999 a, b, c) y Enterobacter intermedium (Kim C.H. et al., Current Microbiol. 47:457-461, 2003), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducidas de dichas cuatro proteínas no caracterizadas se encuentran estrechamente relacionadas con la s-GDH de A. calcoaceticus, con muchos residuos en el sitio activo putativo absolutamente conservados. Dichas proteínas homologas probablemente presentan una estructura similar y catalizan reacciones dependientes de QPQ similares (Oubrie et al., 1999a, b, c; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647:143-151, 2003; Reddy S. y Bruice T.C., J. Am. Chem. Soc. 126:2431-2438, 2004; Yamada M. etal., Biochim. Biophys. Acta 1647:185-192, 2003).

Las s-GDHs y m-GDHs bacterianas se ha encontrado que presentan secuencias bastante diferentes y diferente especificidad de sustrato. Por ejemplo, A. calcoaceticus contiene dos glucosa deshidrogenasas dependientes de QPQ, una denominada m-GDH que se encuentra activa in vivo, y la otra denominada s-GDH para la que sólo puede demostrarse actividad in vitro. Cleton-Jansen et al., 1988, 1989a, b, clonaron los genes codificantes de dos enzimas GDH y determinaron las secuencias de ADN de los dos genes GDH indicados. No existe ninguna homología evidente entre m-GDH y s-GDH que corrobora el hecho de que m-GDH y s-GDH representan dos moléculas completamente diferentes (Laurinavicius V. et al., Biologija, 31-34, 2003).

El gen de la s-GDH de A. calcoacetius ha sido clonado en E. coli. Tras su producción en la célula, la s-GDH se trasloca a través de la membrana citoplasmática hacia el interior del espacio periplásmico (Duine J.A., Energy

generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter, en: "The Biology of Acinetobacter", 295-312, 1991, New York, Plenum Press; Matsushita K. y Adachi O., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol deshydrogenase, en: "Principies and applications of Quinoproteins", 47-63, 1993, New York, Marcel Dekker). Al Igual que la s-GDH nativa de A. calcoaceticus, la s-GDH recombinante expresada en E. coli es un homodímero, con una molécula de QPQ y tres iones calcio en cada monómero (Dokter P. et al., Blochem. J. 239:163-167, 1986; Dokter P. et al., FEMS MIcrobiol. Lett. 43:195-200, 1987; Dokter P. et al., Blochem. J. 254:131-138, 1988; Olsthoorn A.J. y Dulne J.A., Arch. Blochem. Biophys. 336:42-48, 1996; Oubrie A. et al., J. Mol. Blol. 289:319-333, 1999; Oubrie A. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 96:11787-11791, 1999; Oubrie A. et al., Embo J. 18:5187-5194, 1999). La s- GDH oxida un amplio abanico de monosacáridos y disacáridos en las cetonas correspondientes, que se hidrolizan adlclonalmente en los ácidos aldónicos, y también es capaz de donar electrones al PMS (metosulfato de fenazina), DCPIP (2,6-dlclorofenollndofenol), WB (azul de Wurster) y ubiquinonas de cadena corta tales como ubiquinona Q1 y ublqulnona Q2 (Matsushita K. et al., Biochem. 28:6276-6280, 1989; Matsushita K. et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56:63-72, 1989), varios aceptares electrónicos artificiales tales como metilsulfato de N-metil-fenazonio (Olsthoorn A.J. y Duine J.A., Arch. Biochem. Biophys. 336:42-48, 1996; Olsthoorn A.J. y Duine J.A., Biochem. 37:13854-13861, 1998) y polímeros electroconductores (Ye L. et al., Anal. Chem. 65:238-241, 1993). En vista de la elevada actividad especifica de la s-GDH hacia la glucosa (Olsthoorn A.J. y Duine J.A., 1996, supra) y su amplia especificidad de aceptar electrónico artificial, el enzima resulta muy adecuado para aplicaciones analíticas, particularmente para su utilización en (bio)sensores o tiras de ensayo para la determinación de la glucosa en aplicaciones diagnósticas (Kaufmann N. et al., Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinized blood, en: "Glucotrend", 1-16, 1997, Boehringer Mannheim GmbH; Malinauskas A. et al., Sensors and Actuators, B: Chemical 100:395-402, 2004).

La oxidación de la glucosa puede ser catalizada por como mínimo tres grupos de enzimas bastante diferentes, es decir, por las glucosa deshidrogenasas dependientes de NAD/P, por las flavoproteínas glucosa oxidasas o por las quinoproteínas GDH (Duine J.A., Biosens. Bioelectronics 10:17-23, 1995). Se ha observado una autooxidación bastante lenta de la s-GDH reducida, demostrando que el oxígeno es un aceptar electrónico muy pobre para la s- GDH (Olsthoorn y Duine, 1996). La s-GDH puede clonar eficientemente electrones desde la quinona reducida a mediadores tales como PMS, DCPIP, WB y ubiquinonas de cadena corta tales como Q1 y Q2, pero no puede donar eficientemente electrones directamente al oxígeno.

Las tiras de ensayo... [Seguir leyendo]

1. Proteína mutante de s-GDH dependiente de QPQ caracterizada por que en por lo menos una de las posiciones 122 y 124 se encuentra presente el aminoácido lisina, en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones aminoácidas conocidas de la GDH de secuencia de tipo salvaje de A. calcoaceticus (SEC ID n° 2, en la que dicho mutante presenta una mayor estabilidad que la proteína que no presenta dichas sustituciones y en la que dicha proteína es por lo menos 90% idéntica a SEC ID n° 2.

2. Mutante según la reivindicación 1, en el que el aminoácido en la posición 122 es una lisina.

3. Mutante según la reivindicación 1, en el que el aminoácido en la posición 124 es una lisina.

4. Mutante según la reivindicación 1, en el que el aminoácido lisina se encuentra presente tanto en la posición 122 como en la posición 124.

5. Mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una o más sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste de las posiciones 16, 22, 65, 76, 116, 120, 127, 143, 168, 169, 171, 177, 224, 227, 230, 231, 245, 246, 255, 277, 287, 294, 295, 299, 302, 305, 307, 308, 317, 321, 323, 341, 348, 349, 354, 355, 364, 378, 422, 425, 428 y 438.

6. Mutante según la reivindicación 5, en el que dicha sustitución o sustituciones adicionales de aminoácidos son una sustitución en la posición 348.

7. Mutante según la reivindicación 5, en el que dicha sustitución o sustituciones adicionales de aminoácidos son una sustitución en la posición 428.

8. Mutante según la reivindicación 5, en el que dicha sustitución o sustituciones adicionales de uno o más aminoácidos son una sustitución tanto en la posición 348 como en la posición 428.

9. Mutante según la reivindicación 6, en el que la treonina en la posición 348 se sustituye por alanina, glicina o

serina.

10. Polinucleótido aislado codificante de la proteína mutante s-GDH según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado según la reivindicación 10, operablemente ligado a una secuencia de promotor capaz de inducir la expresión de dicho polinucleótido en una célula huésped.

12. Célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 11.

13. Método de detección, determinación o medición de la glucosa en una muestra utilizando un mutante s-GDH según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicha mejora la puesta en contacto de la muestra con

el mutante.

14. Método según la reivindicación 13, que se caracteriza además por que dicha detección, determinación o medición de la glucosa se lleva a cabo utilizando un dispositivo sensor o de tira de ensayo.

15. Dispositivo para la detección, determinación o medición de la glucosa en una muestra que comprende un mutante s-GDH según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y otros reactivos necesarios para dicha medición.