Un método para producir copolímeros polihidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato (PHBH) que comprende:

sintetizar PHBH en una bacteria transgénica que es capaz de asumir butirato o butanol y convertirlo a butiril-CoA y que se transforma con, y expresa, un transgén que codifica una polimerasa PHA que polimeriza 3-hidroxibutiril-CoA. y 3-hidroxihexanoil-CoA para formar PHBH, donde la bacteria transgénica también expresa

(a) un tiolasa que convierte butiril-CoA y acetil-CoA. a 3-CoA ketohexanoil, y

(b) una reductasa que convierte la 3-ketohexanoil-CoA a 3-hydroxyhexanoyl-CoA,

por fermentación de la bacteria transgénica en presencia de butirato o butanol PHBH de tal manera que se produce, y la recuperación de la PHBH

Sistemas transgénicos para la fabricación de poli(3-hidroxi-butirato-co-3-hidroxihexanoato).

Antecedentes de la invención

La presente invención esta generalmente en el campo de los materiales polihidroxialcanoatos, y mas concretamente para mejorar los métodos de producción de los mismos.

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son poliésteres termoplásticos naturales y pueden ser procesados por técnicas de polímeros tradicionales para el uso en variedades enormes de aplicaciones, incluido el envasado de productos de consumo, los revestimientos de pañales desechables y bolsas de basuras, alimentos y productos médicos. Los métodos que pueden ser usados para producir polímeros PHA a partir de microorganismos que producen naturalmente polihidroxialcanoatos son descritos en la patente U.S. No. 4,910,145 a Holmes, et al.; Byrom, "Biomateriales Varios" en Biomateriales (Byrom, ed.) pp. 333-59 (Editores Macmillan, Londres 1991); Hocking y Marchessault, "Biopoliesteres" en Química y Tecnología de Polímeros Biodegradables (Griffin, ed.) pp. 48-96 (Chapman & Hall, Londres 1994); Holmes, "Producido Biológicamente (R)-3-hidroxialcanoato Polímeros y Copolímeros" en Desarrollos en Polímeros Cristalinos (Bassett, ed.) vol. 2, pp. 1-65 (Elsevier, Londres 1988); Lafferty et al., "La producción microbiana de Poly-b-hidroxibutírico" en Biotecnología (Rehm & Reed, eds.) vol. 66, pp. 135-76 (Verlagsgesellschaft, Weinheim 1988); Müller & Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:477-502 (1993). La ruta de biosíntesis natural para la producción de polihidroxibutirato (PHB) se muestra en la Figura 1.

Los métodos para la producción en organismos PHAs naturales o genéticamente modificados son descritos por Steinbüchel, "Ácidos Polihidroxialcanoicos" en Biomateriales (Byrom, ed.) pp. 123-213 (Editores Macmillan, Londres 1991); Williams & Peoples, CHEMTECH, 26:38-44 (1996); Steinbüchel & Wiese, Appl. Microbiol. Biotechnol., 37:691-97 (1992); U.S. Patentes Nos. 5,245,023; 5,250,430; 5,480,794; 5,512,669; 5,534,432 a Peoples y Sinskey (el cual revela y afirma los genes que codifican reductasa, tiolasa, y la polimerasa PHB); Agostini et al., Polym. Sci., Part A-1, 9:2775-87 (1997); Gross et al., Macromoléculas, 21:2657-68 (1988); Dubois, et al., Macromoléculas, 26:4407-12 (1993); Le Borgne & Spassky, Polímero, 30:2312-19 (1989); Tanahashi & Doi, Macromoléculas, 24:5732-33 (1991); Hori et al, Macromoléculas, 26:4388-90 (1993); Kemnitzer et al., Macromoléculas, 26:1221-29 (1993); Hori et al., Macromoléculas, 26:5533-34 (1993); Hocking & Marchessault, Polym. Bull., 30:163-70 (1993); Xie et al., Macromoléculas, 30:6997-98 (1997); y la patente U.S. No. 5,563,239 a Hubbs et al. Una vía general para la producción de PHAs se muestra en la figura 2. Los enfoques de síntesis del polímero sintético incluyendo condensación directa y polimerización de anillo abierto de las lectonas correspondientes son descritas en Jesudason & Marchessault, Macromoléculas 27:2595-602 (1994); Patente U.S. No. 5,286,842 a Kimura; Patente U.S. No. 5,563,239 a HUbbs et al., Patente U.S. No. 5,516,883 a Hori et al., Patente U.S. No. 5,461,139 a Gonda et al.; y Solicitud de Patente Canadiense No. 2,006,508. WO 95/15260 describe la fabricación de películas poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV), y Patentes U.S. Nos. 4,826,493 y 4,880,592 a Martini et al. describen la fabricación de películas PHB y PHBV. Patente U.S. No. 5,292,860 a Shiotani et al. describe la fabricación del copolímero PHA poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) (PHBH).

A la fecha, los PHAs han tenido limitada disponibilidad comercial, siendo solo disponible el copolímero PHBV en cantidades para desarrollo. Este copolímero ha sido producido por fermentación de la bacteria Ralstonia eutropha. Procesos de fermentación para la producción de otros PHAs han sido desarrollado (Williams & Peoples, CHEMTECH 26:38-44 (1996)). Los cultivos de plantas también están siendo diseñados genéticamente para producir estos polímeros, ofreciendo una estructura de costes en línea con los aceites vegetales y competitividad directa en precio con los polímeros a base de petróleo (Williams & Peoples, CHEMTECH 26:38-44 (1996)).

Varios factores son críticos por la producción biológica económica de PHAs, incluidos los costes de sustratos, tiempo de fermentación, y la eficiencia de operaciones posteriores de transformación. Para la fermentación a gran escala de productos básicos, es generalmente conocido que el sistema basado en plásmido no es satisfactorio debido a la carga extra de mantenimiento de los plásmidos y problemas en el mantenimiento de la expresión estable.

Los sistemas biológicos conocidos para la producción de PHAs conteniendo 3-hidroxi-co-hidroxihexanoato (3H-co-HH) son ineficientes. Por ejemplo, Shimamura, et al., Macromoléculas, 27:878 (1994) revela que las Aeromonas caviae sintetiza un compuesto PHA de 3-hidroxibutirato y 3-hidroxihexanoato (3HH) cuando se cultivan en aceite de oliva o ácidos grasos de C₁₂ a C₁₈. Se determinó que la fracción del monómero 3HH es dependiente de la concentración de la fuente de carbono y el tiempo de fermentación y puede llegar a niveles de 25% (Doi, et al., Macromoléculas, 28:4822 (1995)). Como resultado del crecimiento de niveles de sustrato de 3HH, la cristalinidad, temperatura de fusión, y la temperatura de transición del vidrio de los PHA decrecen. Estos cambios en propiedades físicas llevan a un aumento de susceptibilidad a la degradación por depolimerasa PHB de Alcaligenes faecalis. Otro microorganismo natural que incorpora niveles bajos de 3HH en un copolímero PHB son Comamonas testosteroni y Bacillus cereus (Huisman, et al., Appl. Environ. Microbiol. 55:1949 (1989); Caballero, et al., Int. J Biol. Macromol., 17:86 (1995)). Las cepas de Pseudomonas putida GPp104 recombinante en las que los genes phb de cualquier Thiocapsia pfenigii o Chromatiun vinosum fueron introducidos también acumularon PHA con 3-hidroxihexanoato como componente principal.

PHAs están divididos generalmente en dos clases basados en la composición del polímero: PHAs de cadena lateral corta y PHAs de cadena lateral larga . La incorporación de monómeros de un grupo dentro de un PHA perteneciente a otro usualmente es limitada a niveles bajos. En algunos casos donde los monómeros son abundantes para ambos PHAs, la bacteria generalmente produce gránulos de PHA por separado cada uno comprendiendo un tipo de PHA. Las especificidades de sustrato de las polimerasas PHA pueden en consecuencia ser generalizadas como optimas para las cadenas laterales cortas (C₄ y C₅) o cadenas laterales medias (C₈-C₁₀). Basado en la composición de los PHAs sintetizados por microorganismos individuales, pueden ser identificadas polimerasas PHA que incorporan 3-hidroxihexanoato. Así, las polimerasas PHA de A. caviae, C. testosteroni y T. pfenigii son conocidas por incorporar 3-hidroxihexanoato en la PHA, considerando que los enzimas de Paracoccus denitrificans, Sphaerotilus natans y Rhodococcus sp. tienen preferencia por 3-hidroxivalerato. Las polimerasas PHA de estos últimos organismos también son útiles para hacer copolímeros PHB-co-HH, debido a su preferencia por C₅ sobre C₄. Lamentablemente, sin embargo, estas bacterias tienen una baja tasa de crecimiento, a veces son difíciles de romperse, y solo tienen una docilidad limitada a la ingeniería genética. Es en consecuencia deseable desarrollar formas de producción de PHAs más rentables y eficientes que contengan 3H-co-HH por sistemas biológicos.

Es por lo tanto un propósito de la presente invención el proveer sistemas de ingeniería genética para la producción de polímeros polihidroxialcanoatos incluyendo 3-hidroxihexanoato monómeros (HHPHA).

Es otro propósito de esta invención el proveer mutaciones útiles las cuales pueden ser usadas para producir monómeros 3-hidroxihexanoicos a partir de materias primas mas económicas, tales como butirato o butanol.

Es además un propósito de esta invención el proveer genes adecuados para la conversión de metabolitos celulares derivados de materias primas de carbohidratos para Butiril-CoA para la producción de comonómeros 3-hidroxiexanoatos.

Es otro propósito de esta invención el proveer métodos mejorados en la producción de PHAs conteniendo 3-hidroxihexanoato como comonómero.