Polímero bioabsorbible conteniendo monómeros 2-hidroxiácidos.

Un método de producir un polímero de polihidroxialcanoato comprendiendo ácido glicólico,

en un organismooseleccionado del grupo que consta de levadura, bacterias, hongos, y plantas, el método comprendiendo:

(a) expresar en el organismoo genes codificando un polihidroxialcanoato (PHA) sintasa y enzimas para laformación de glicolil-CoA de 1,4-butanodiol; y

(b) cultivar el organismo en la presencia de 1,4-butanodiol de manera que se forma y se incorpora glicolil-CoA en un polímero PHA;

donde la vía para la degradación de ácidos grasos es inducida en el organismo; y donde las enzimas parala formación de glicolil-CoA incluye aldehído deshidrogenasa, diol óxidoreductasa, y acil-COA transferasa.

Polímero bioabsorbible conteniendo monómeros 2-hidroxiácidos.

Antecedentes de la invención [0001] La presente invención está generalmente en el campo de los métodos para hacer monómeroos 2hidroxiácidos, y los polímeros polihidroxialkanoato resultantes.

Numerosos microorganismoos tienen la capacidad de acumular reservas intracelulares de polimeros poli [ (X) 3-hidroxialkanoatos] ("PHA") . Los PHAs son sustancias termoplásticas biodegradables, producidas a partir de recursos renovables, con una amplia variedad de aplicaciones biomédicas e industriales (Williams and Peoples, 1996, CHEMTECH 26, 38-44) . Alrededor de 100 monómeros distintos se han incorporado en polímeros PHA, como se informa en la literatura (Steinbüchel and Valentin, 1995, FEMS Microbiol. Lett. 128; 219-228) y recientemente se ha revisado la biología y genética de su metabolismo (Huisman and Madison, 1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 63: 21-53) .

Se han desarrollado procesos de fermentación y recuperación para una gama de tipos de PHA utilizando una variedad de bacterias que incluyen Azotobacter, Alcaligenes latus, Comamonas testosteroni y por ingeniería genética E. coli y Klebsiella, como recientemente se revisó por Braunegg et al., 1998, Journal of Biotechnology 65: 127-161; Choi and Lee, 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51: 13-21. Se han examinado enfoques más tradicionales de síntesis de polímeros, incluyendo la condensación directa y polimerización por apertura de anillo de las lactonas correspondientes (Jesudason and Marchessault, 1994, Macromolecules 27: 2595-2602) .

Se ha descrito la síntesis de polímeros PHA que contienen el monómero 4-hidroxibutirato (PHB4HB, Doi, Y.1995, Macromol. Symp. 98, 585-599) o poliésteres PHA que contienen 4-hidroxivalerato y 4-hidroxihexanoato (Valentin et al., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36, 507-514 y Valentin et al., 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 710-716) . Los copolímeros PHB4HB pueden ser producidos con una variedad de composiciones de monómeros que proporcionan una variedad de propiedades poliméricas (Saito, Y, Nakamura, S., Hiramitsu, M. and Doi, Y., 1996, Polym. Int. 39: 169) .

WO 99/32536 revela homo-y co-polímeros PHA, basados en ácido 4-hidroxibutirico, que tienen velocidades de degradación controladas. Estas composiciones pueden ser utilizadas en aplicaciones médicas, tales como ingeniería de tejidos, administración de fármacos y técnicas de tratamiento de imágenes.

El homopolímero poli (4-hidroxibutirato) , o P4HB, ha sido sintetizado en E. coli recombinante (Hein et al., 1997, FEMS Microbiol. Lett. 153:411-418) utilizando PHA sintasa de Ralstonia eutropha procedente de plásmido (phaC) y los genes de 4HB-CoA transferasa de Clostridium kluyveri (orfZ) .

Khelifa et al, 1998, Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 8; 3429-3434, describe la síntesis de polímeros conteniendo 2-hidroxiácidos en Clostridium butyricum de aminoácidos L y D-2.

Se han descrito también copolímeros PHA de 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxipropionato (Shimamura et. al., 1994, Macromolecules 27: 4429-4435; Cao et. al., 1997, Macromol. Chem. Phys. 198: 3539-3557) . El nivel más alto de 3-hidroxipropionato incorporado en estos polímeros es 88 mol % (Shimamura et. al., 1994, 27: 4429-4435 Macromoléculas) .

WO 02/08428A2 a Metabolix Inc. describe bacterias desarrolladas por ingeniería genética para la producción de copolímeros PHA de materias primas de poliol. Aunque más de 100 monómeros diferentes han sido incorporados en PHAs en organismos, nunca se ha informado de la presencia de ácido glicólico en un PHA biosintético. El ácido glicólico es el más sencillo de los hidroxiácidos, y previamente se han sintetizado químicamente polímeros conteniendo ácido glicólico. Por ejemplo, polímeros de ácido glicólico de alto peso molecular son preferiblemente preparados por polimerización por apertura de anillo a partir del dímero cíclico, glicólido. Polímeros conteniendo ácido glicólico se usan en suturas absorbibles, dispositivos de fijaciones internas, andamiajes de ingeniería de tejidos, matrices de liberación de fármacos, etc. Ver, por ejemplo, la patente U.S. Nº. 3.867.190; la patente U.S. Nº. 3, 736, 646; Fukuzaki, et al., "Un nuevo copolímero biodegradable de ácido glicólico y lactonas con peso molecular relativamente bajo preparado por copolicondensación directa en ausencia de catalizadores " en J. Biomed. Mater. Res. 25 (3) :315-28 (1991) . Se han utilizado polímeros sintéticos que contienen ácido glicólico para dispositivos médicos absorbibles desde los años 70. Ver por ejemplo, Chujo, et al., "Polimerización por apertura de anillo de glicólido " en Makromol. Chem. 100:262-6 (1967) ; Fukuzaki, et al., "Copolimerización directa de ácido glicólico con lactonas en ausencia de catalizadores " en Eur. Polym. J. 26 (4) :457-61 (1990) ; Kricheldorf, et al., "Polilactonas, 2. Copolimerización de glicólido con º-propiolactona, y-butirolactona o o-valerolactona" en Makromol. Chem. 186 (5) :955-76 (1985) ; Kricheldorf, et al., "Polilactonas, 3. Copolimerización de glicólido con L, L-lactida y otras lactonas" en Makromol. Chem. 12 (Polym. Specific Prop.) :955-76 (1985) ; Nakayama, et al., "Síntesis y biodegradabilidad de copoliésteres novedosos que contienen unidades dey -butirolactona " en Polymer 39 (5) :12131222 (1998) ; Nakayama, et al., "Síntasas de poliésteres biodegradables y efecto de la estructura química en la degradación " en Nippon Kagaku Kaishi 1:1-10 (2001) . Sin embargo, los copolímeros formados de ácido glicólico y diversas lactonas por síntesis química tienen pesos moleculares relativamente bajos. Es más, es difícil controlar la configuración estéreo de las unidades de lactona en los copolímeros formados por síntesis química.

Sería útil poder incorporar ácido glicólico en polímeros PHA en los sistemas de producción de bacterias. Esto expandiría más la variedad de propiedades físicas disponibles de la familia PHA de polímeros y la presencia de los monómeros de ácido glicólico proporcionaría un medio para controlar la velocidad de degradación de los PHAs para usos biomédicos e industriales. En concreto, la incorporación de ácido glicólico en PHAs proporcionaría un medio para controlar la velocidad de degradación in vivo de dispositivos biomédicos de PHA utilizando un monómero ya con antecedentes de uso seguro en implantes médicos.

Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar un método para la biosíntesis de PHAs conteniendo ácido glicólico.

Es otro objeto de esta invención el proporcionar métodos para la biosíntesis de PHAs conteniendo ácido glicólico y al menos otro monómero tal como ácido 3-hidroxibutírico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido 3hidroxivalérico, ácido 3-hidroxihexanoico, ácido 3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxidecanoico, ácido 4-hidroxibutírico o ácido 4-hidroxivalérico. PHAs específicos de interés que contienen ácido glicólico incluyen poli-ácido-3hidroxibutírico -co-ácido glicólico y poli-ácido-4-hidroxibutírico-co-ácido glicólico.

Es además un objeto de la presente invención proporcionar PHAs que contienen 2-hidroxiácidos por biosíntesis para aplicaciones médicas e industriales.

Resumen de la Invención [0014] Se ha desarrollado una clase de copolímeros PHA conteniendo ácido glicólico y el método de fabricar y utilizar los mismos. Los copolímeros que contienen ácido glicólico pueden ser sintetizados por medio de biosíntesis por la acción de una PHA polímerasa en una célula viva. Al cambiar los antecedentes genéticos de las células uno puede controlar vías metábolicas específicas que producen el tioéster de la Coenzima A de ácido glicólico que puede incorporarse en polímeros PHA por una enzima sintasa de PHB o PHA. En una realización representativa, el método aquí descrito produce polímero conteniendo ácido glicólico por expresión en un organismo genes que codifican polihidroxialcanoato sintasa (PHA sintasa) y enzimas para la formación de glicolil-CoA. La PHA sintasa puede ser una sintasa PHB o PHA. Las enzimas para la formación de glicolil-CoA incluyen, por ejemplo, deshidrogenasa aldehído, óxidoreductasa diol, y/o transferasa acil-COA. Pueden usarse también genes adicionales que codifican acetoacetil-CoA reductasa, y beta-ketoacil-CoA tiolasa para proporcionar otros precursores de comonómero PHA tal como 3-hidroxibutiril-CoA. En una realización preferida, los PHAs resultantes contienen ácido glicólico y al menos un monómero diferente tal como ácido 3-hidroxibutírico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido 3hidroxivalérico, ácido 3-hidroxihexanoico, ácido 3-hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxidecanoico, ácido 4-hidroxibutírico... [Seguir leyendo]

1. Un método de producir un polímero de polihidroxialcanoato comprendiendo ácido glicólico, en un organismoo seleccionado del grupo que consta de levadura, bacterias, hongos, y plantas, el método comprendiendo:

(a) expresar en el organismoo genes codificando un polihidroxialcanoato (PHA) sintasa y enzimas para la formación de glicolil-CoA de 1, 4-butanodiol; y

(b) cultivar el organismo en la presencia de 1, 4-butanodiol de manera que se forma y se incorpora glicolil-CoA en un polímero PHA;

donde la vía para la degradación de ácidos grasos es inducida en el organismo; y donde las enzimas para la formación de glicolil-CoA incluye aldehído deshidrogenasa, diol óxidoreductasa, y acil-COA transferasa.

2. Uso de un organismo, seleccionado a partir del grupo que consiste en levadura, bacterias, hongos, y plantas, para convertir 1, 4-butanodiol en glicoil Co-A y por ello producir un polímero de polihidroxialcanoato que comprende ácido glicólico, donde el organismo expresa genes codificando un polihidroxialcanoato (PHA) sintasa y enzimas para la formación de glicolil-CoA incluyendo aldehído deshidrogenasa, diol oxidoreductasa, y acil-COA transferasa; y donde la vía de degradación de ácidos grasos es inducida en el organismo.

3. El método de la reivindicación 1 o uso de la Reivindicación 2 donde la PHA sintasa es una sintasa de poli (3hidroxialcanoato) o poli (4-hidroxialcanaoto) .

4. El método de la reivindicación 1 o uso de la Reivindicación 2 donde el organismo comprende además uno o más genes codificando enzimas seleccionadas del grupo que consiste en acetoacetil-CoA reductasas y beta-ketoacil-CoA tiolasas.

5. El método de la reivindicación 1 o uso de la Reivindicación 2 donde la PHA sintasa es poli (3-hidroxialcanoato) sintasa.

6. El método de la reivindicación 1 o uso de la Reivindicación 2 donde la PHA sintasa es poli (4-hidroxialcanoato) sintasa.

7. El método de la reivindicación 1 o uso de la reivindicación 2 donde la PHA sintasa es poli (4-hidroxibutirato) sintasa.

8. El método de la reivindicación 1 o uso de la Reivindicación 2 donde el organismo es una bacteria.

9. El método de la reivindicación 1 o uso de la reivindicación 2 donde el organismo es E. coli.

10. El método de la reivindicación 1 o uso de la Reivindicación 2 donde el organismo es E. coli que tiene mutaciones seleccionadas de mutaciones constutivas fadR601 y atoC.

11. El método de la reivindicación 1, o el uso de la Reivindicación 2, donde la aldehído deshidrogenasa es de E. coli, donde la diol óxidoreductasa es de Klebsiella pneumoniae, y donde la acil-COA transferasa es de Clostridium kluyveri.

12. El método de la Reivindicación 1 o el uso de la Reivindicación 2 donde el polímero de polihidroxialcanoato es poli (4-hidroxibutirato-co-glicolato) .

13. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 ó 3 a 12 donde el polímero de polihidroxialcanoato así producido está formado en fibras, peliculas, espumas, artículos moldeados, o un dispositivo médico, tal como un dispositivo médico seleccionado del grupo que consta de dispositivos para la liberación controlada de agentes de diagnóstico, profilácticos o terapéuticos; administración de fármacos; andamiajes o matrices en ingeniería de tejidos; dispositivos para encapsulación de células; dispositivos para la administración dirigida de agentes de diagnóstico, profilácticos o terapéuticos; revestimientos biocompatibles; implantes biocompatibles; dispositivos guiados de regeneración de tejidos; apósitos para heridas; dispositivos ortopédicos; prótesis y cementos óseos; dispositivos diagnósticos, varillas, tornillos óseos, grapas, suturas quirúrgicas, stents, y parches tales como parches para hernias y parches pericárdicos.

14. El método de la Reivindicación 13 donde el polímero de polihidroxialcanoato así producido se forma en fibras y las fibras son usadas para hacer artículos sin tejer o tricotados útiles en telas, toallitas desechables y/o artículos sanitarios.

15. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 3 a 12 donde el polímero de polihidroxialcanoato así producido se mezcla con otras sustancias, tales como polímeros biodegradables como ácido poliláctico, almidón o almidones químicamente modificados o poliésteres sintéticos que contienen ácido tereftálico, ácido succínico, 1, 4butanodiol o ácido adípico como bloques de construcción y que pueden ser biodegradables.

16. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 3 a 12 donde el polímero polihidroxialcanoato así producido se formula con una ayuda de procesamiento seleccionada de nucleantes, plastificantes, agentes de reticulación, estabilizadores témicos, colorantes, rellenos y agentes antibloqueantes.