Un constructo de DNA para expresión de productos de genes múltiples en una célula eucariota,

comprendiendo el constructo de DNA una casete que está constituida por las características que se muestran, en la dirección 5'' a 3'', en la fórmula siguiente:

(i)-(ii)-[(iii)-(iv)]n-(v)

(a) en la cual:

(i) es un promotor simple en el extremo 5'' de la casete,

(ii) es una secuencia de DNA que codifica una proteína exteína N-terminal;

(iii) es una secuencia de DNA que codifica una inteína,

(iv) es una secuencia de DNA que codifica una proteína exteína C-terminal, y

(v) es una región no codificante 3'' que es operativa como secuencia de terminación de la transcripción, y comprende una señal de poliadenilación,

(b) en la cual n es un número entero de uno o más, y

(c) en la cual (ii)-[(iii)-(iv)]n, como se muestra en la fórmula anterior codifican juntos una unidad de remodelación de inteína modificada que se expresa como una sola poliproteína precursora y que cataliza la escisión de las exteínas de la o de cada una de las inteínas, y previene la ligación de las exteínas

Constructos de expresión multigénicos que contienen inteínas modificadas.

Antecedentes de la invención

Esta solicitud reivindica prioridad respecto a U.S.S.N. 60/181.739, presentada el 11 de febrero de 2000.

La manipulación genética de las cosechas de plantas para producir rasgos de aporte acumulados, tales como tolerancia a herbicidas y resistencia a los insectos, o productos con valor añadido tales como polihidroxialcanoatos (PHAs), requiere la expresión de genes extraños múltiples. La metodología de reproducción transicional utilizada para ensamblar más de un gen en una planta requiere ciclos repetidos de producción y cruzamiento de líneas homocigóticas, un proceso que contribuye significativamente al coste y tiempo para generar plantas transgénicas adecuadas para producción en campo (Hitz, B. Current Opinion in Plant Biology, 1999, 2, 135-138). Este coste podría reducirse drásticamente por la inserción multigénica en una planta en un solo suceso de transformación.

Halpin et al. 1999, The Plant Journal, 17(4), 453-459 informan que es difícil la expresión coordinada, de nivel alto y estable de transgenes múltiples en las plantas. Halpin et al. informan también que en el virus de la enfermedad de la fiebre aftosa (FMDV), una secuencia (2A) de solo 16-20 aminoácidos parece tener la capacidad singular de mediar la escisión en su propio término C por un nuevo tipo de reacción aparentemente independiente de enzimas, y que esta secuencia puede mediar también la escisión en un contexto heterólogo de proteínas dentro de una gama de sistemas de expresión eucariotas. Halpin et al. informan acerca de la construcción de un plásmido en el cual la secuencia 2A está insertada entre los genes informadores cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) y ß-glucuronidasa (GUS), manteniendo un solo marco de lectura abierto, y la expresión de este constructo en lisado de germen de trigo y plantas transgénicas que se dice dan como resultado escisión eficiente de la poliproteína y expresión coordinada de CAT y GUS activos. Halpin et al. proponen que el autoprocesamiento de poliproteínas utilizando la secuencia 2A de FMDV podría proporcionar un sistema para asegurar la expresión coordinada y estable de proteínas múltiples introducidas en células de plantas.

WO 9521249 informa que una casete para expresión simultánea de dos o más polipéptidos heterogéneos en cantidades equimolares puede estar basada en la proteasa de inclusión nuclear (NIa) del potivirus del moteado del tabaco. Los autores informan que los péptidos heterogéneos se traducen e incorporan en un polipéptido que incluye también la proteasa que libera las proteínas heterólogas después de la traducción por reacción autoproteolítica.

La creación de un solo vector que contiene casetes multigénicas, flanqueados cada uno por un promotor y una secuencia de poliadenilación, permite un suceso de transformación simple, pero puede conducir a la silenciación de genes si cualquiera de las secuencias promotora o de poliadenilación son homólogas (Matzke, M., Matzke, A. J. M., Scheid, O. M. In Homologous Recombination y gen Silencing en Plants; Paszkowski, J. Ed. Kluwer Academic Publishers, Países Bajos, 1994; pp 271-300). Pueden emplearse promotores múltiples únicos, pero la coordinación de la expresión es difícil. Los investigadores han coordinado la expresión multigénica a partir de un solo promotor por manipulación genética de sitios de escisión de ribozimas en constructos multigénicos de tal modo que se produce un RNA policistrónico que puede escindirse subsiguientemente en un RNA monocistrónico (U.S. 5519164). Se han expresado también genes múltiples como una poliproteína en la cual las regiones codificantes están unidas por sitios de reconocimiento de proteasas (Dasgupta, S., Collins, G.B., Hunt, A. G. The Plant Journal, 1998, 16, 107-116). Una proteasa coexpresada libera las enzimas individuales pero deja a menudo residuos del sitio de escisión de la proteasa que pueden afectar a la actividad de las enzimas.

La remodelación de proteínas, un proceso en el cual una región interior de una proteína precursora (una inteína) se escinde y las regiones flanqueantes de la proteína (exteínas) se ligan para formar la proteína madura (Figura 1a), ha sido observado en numerosas proteínas tanto de procariotas como de eucariotas (Perler, F. B., Xu, M. Q., Paulus, H. Current Opinion in Chemical Biology 1997, 1, 292-299; Perler, F. B. Nucleic Acids Research 1999, 27, 346-347). La unidad inteína contiene los componentes necesarios precisos para catalizar la remodelación de la proteína y contiene a menudo un dominio de endonucleasa que participa en la movilidad de la inteína (Perler, F. B., Davis, E. O., Dean, G. E., Gimble, F. S., Jack, W. E., Neff, N., Noren, C. J., Thorner, J., Belfort, M. Nucleic Acids Research 1994, 22, 1127-1127). Sin embargo, las proteínas resultantes están enlazadas, no expresadas como proteínas separadas.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un método y medios para producir constructos de expresión multigénicos, especialmente para expresión en plantas de proteínas múltiples separadas.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método y medios para la expresión coordinada de genes que codifican proteínas múltiples, o copias múltiples de proteínas, especialmente proteínas implicadas en caminos metabólicos o caminos para fabricación de nuevos productos.

Sumario de la invención

Se describen métodos y constructos para introducción de genes múltiples en eucariotas, tales como plantas, utilizando un solo suceso de transformación.

De acuerdo con ello, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un constructo de DNA para expresión de productos de genes múltiples en una célula eucariota, comprendiendo el constructo de DNA una casete que está constituida por las características que se muestran, en la dirección 5' a 3', en la fórmula siguiente:

(i)-(ii)-[(iii)-(iv)]_n-(v)

En una realización del primer aspecto de la presente invención, n puede ser un número entero mayor que 1 y la unidad de remodelación de inteína modificada codifica más de dos proteínas exteína.

En otra realización del primer aspecto de la presente invención, la unidad de remodelación de inteína modificada puede comprender elementos de inteína de fuentes diferentes.

En otra realización del primer aspecto de la presente invención, la célula puede ser una célula de levadura y el promotor es un promotor operativo en la célula de levadura, o la célula puede ser una célula de planta y el promotor es un promotor operativo en una célula de planta, o la célula puede ser una célula de mamífero y el promotor es operativo en una célula de mamífero.

En otra realización del primer aspecto de la presente invención, el promotor puede seleccionarse del grupo constituido por promotores inducibles, promotores constitutivos y promotores específicos de tejido.

En otra realización del primer aspecto de la presente invención, las secuencias de exteína que codifican una o más proteínas están precedidas...

1. Un constructo de DNA para expresión de productos de genes múltiples en una célula eucariota, comprendiendo el constructo de DNA una casete que está constituida por las características que se muestran, en la dirección 5' a 3', en la fórmula siguiente:

(i)-(ii)-[(iii)-(iv)]_n-(v)

2. El constructo de la reivindicación 1 en el cual n es un número entero mayor que 1 y la unidad de remodelación de inteína modificada codifica más de dos enzimas exteína.

3. El constructo de la reivindicación 2 en el cual la unidad de remodelación de inteína modificada comprende elementos de inteína de diferentes fuentes.

4. El constructo de la reivindicación 1 en el cual la célula es una célula de levadura y el promotor es un promotor operativo en la célula de levadura.

5. El constructo de la reivindicación 1 en el cual la célula es una célula de planta y el promotor es un promotor operativo en una célula de planta.

6. El constructo de la reivindicación 1 en el cual la célula es una célula de mamífero y el promotor es un promotor operativo en una célula de mamífero.

7. El constructo de la reivindicación 1 en el cual el promotor se selecciona del grupo constituido por promotores inducibles, promotores constitutivos y promotores específicos de tejido.

8. El constructo de la reivindicación 1 en el cual las secuencias de exteína que codifican una o más proteínas están precedidas o seguidas por una secuencia que codifica un péptido que dirige el producto de expresión de las secuencias de exteína a un compartimiento particular dentro de la célula en la cual se expresa el constructo.

9. El constructo de la reivindicación 1 ó 2 en el cual las proteínas exteína son proteínas diferentes.

10. El constructo de la reivindicación 1 ó 2 en el cual las proteínas exteína son proteínas iguales.

11. El constructo de DNA de la reivindicación 1 en el cual el constructo de DNA codifica una glicina o alanina en el primer residuo del término N de la exteína enlazada al término C de una inteína.

12. El constructo de DNA de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la unidad de remodelación de inteína modificada comprende secuencias de exteína que codifican enzimas que catalizan pasos diferentes en un camino metabólico.

13. El constructo de la reivindicación 1 ó 5 en el cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido por acil-CoA-deshidrogenasas, acil-CoA-oxidasas, catalasas, subunidades alfa de oxidación en beta, subunidades beta de oxidación en beta, PHA-sintasas con especificidad de sustrato de longitud de cadena media, beta-cetotiolasas, reductasas dependientes de NADH o NADPH, PHA-sintasas con especificidad de longitud de cadena corta, y PHA-sintasas que incorporan a la vez sustratos de longitud de cadena corta y media.

14. El constructo de la reivindicación 1 ó 5 en el cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido por enzimas codificadas por el locus phaG, sintasas de longitud de cadena media, beta-cetotiolasas, reductasas dependientes de NADH o NADPH, y PHA-sintasas que incorporan a la vez sustratos de longitud de cadena corta y media.

15. El constructo de la reivindicación 5 en el cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido por resistencia a los herbicidas, resistencia a los insectos, y rasgos deseables de plantas de cosecha.

16. Un método para expresar genes múltiples de células que comprende transformar las células con el constructo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el cual las células son células eucariotas, tales como células seleccionadas del grupo constituido por células de mamífero, células de planta y células de levadura, y en el cual si las células son células animales, entonces el método es un método in vitro.

17. Una célula eucariota que produce proteínas recombinantes que comprenden el constructo de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

18. El método de la reivindicación 16, en el cual la célula eucariota es una célula de levadura y el promotor es un promotor operativo en la célula de levadura.

19. El método de la reivindicación 16, en el cual la célula eucariota es una célula de planta y el promotor es un promotor operativo en una célula de planta.

20. El método de la reivindicación 19 para producir hidroxialcanoatos en plantas, en el cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido por acil-CoA-deshidrogenasas, acil-CoA-oxidasas, catalasas, subunidades alfa de oxidación en beta, subunidades beta de oxidación en beta, PHA-sintasas con especificidad de sustrato de longitud de cadena media, beta-cetotiolasas, reductasas dependientes de NADH o NADPH, PHA-sintasas con especificidad de longitud de cadena corta, y PHA-sintasas que incorporan sustratos con longitud de cadena tanto corta como media.

21. El método de la reivindicación 19 para producir polihidroxialcanoatos en plantas, en el cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido por enzimas codificadas por el locus phaG, sintasas de longitud de cadena media, beta-cetotiolasas, reductasas dependientes de NADH o NADPH y PHA-sintasas que incorporan a la vez sustratos de longitud de cadena corta y media.

22. El método de la reivindicación 19, en el cual las proteínas exteína se seleccionan del grupo constituido por resistencia a herbicidas, resistencia a los insectos, y rasgos deseables de plantas de cosecha.

23. El constructo de la reivindicación 1, que comprende una sola unidad de remodelación de inteína modificada, en el cual la unidad de remodelación modificada única está constituida por una secuencia de inteína que tiene un extremo 5' y un extremo 3', en el cual una primera secuencia de exteína está fusionada al extremo 5' de la secuencia de inteína, y una segunda secuencia de exteína está fusionada al extremo 3' de la secuencia de inteína.

24. Un constructo de DNA que comprende:

en donde la primera región codificante, la secuencia de inteína y la segunda región codificante codifican juntas una unidad de remodelación de inteína modificada que se expresa como una poliproteína precursora simple y que cataliza la escisión de las secuencias proteínicas codificadas por las regiones codificantes primera y segunda de la inteína, y previene la ligación de las secuencias de proteína codificadas por las regiones codificantes primera y segunda.

25. Uso del constructo de DNA de la reivindicación 24 para causar la expresión de las regiones codificantes primera y segunda en una célula de planta.

26. Una célula de planta que comprende un constructo como se define por la reivindicación 24.