MÉTODO PARA PRODUCIR POLIHIDROXIALCANOATO.

Un método para producir polihidroxialcanoato (PHA), que comprende (i) cultivar en un medio de cultivo que comprende ácido tereftálico y/o una sal del mismo y/o un éster del mismo una o más cepas bacterianas que son capaces de acumular PHA a partir de ácido tereftálico o una sal o un éster del mismo y que se seleccionan de la cepa GO16 de Pseudomonas putida que tiene el número de registro NCIMB 41538,

la cepa GO19 de Pseudomonas putida que tiene el número de registro NCIMB 41537 y la cepa GO23 de Pseudomonas frederiksbergensis que tiene el número de registro NCIMB 41539; y (ii) recuperar el PHA producido del medio de cultivo

Metodo para producir polihidroxialcanoato La presente invenci6n se refiere a un metodo para producir polihidroxialcanoato (PHA) y a nuevas cepas bacterianas usadas en el metodo.

El poli (tereftalato de etileno) (PET) es uno de los muchos plasticos basados en productos petroquimicos que contribuyen mucho a la comodidad de la vida diaria. El mejor conocido en todo el mundo para su uso en botellas de plastico, se produce a una escala de muchos millones de toneladas en todo el mundo. Oebido al exito del PET, se ha convertido, como otros plasticos, en un problema de residuos principal. Mas de 5.400 millones de libras (2.400 millones de kg) de botellas de PET estaban en los estantes en los Estados Unidos en 2006. En general, menos del 25% de estas botellas se reciclan, y asi la gran mayoria de las botellas de PET en todo el mundo terminan en un vertedero. Esto ocurre a pesar de que esta disponible una variedad de tecnologias de reciclado tales como trituraci6n mecanica para el uso de PET residual en la industria de las fibras, el reprocesamiento de PET residual para la utilizaci6n en contacto con alimentos, y pir6lisis (tratamiento termico en ausencia de aire) de PET residual para generar materiales de alimentaci6n quimicos.

El PET puede degradarse mediante pir6lisis hasta sus componentes monomericos, acido tereftalico y etilenglicol. Sin embargo, el acido tereftalico resultante se usa generalmente como un material de alimentaci6n quimico para la resintesis de PET, que es un producto no biodegradable y por consiguiente de poco valor. Asi, factores tales como el coste relativamente alto de la clasificaci6n de PET residual y el poco valor del producto aguas abajo contribuyen a los escasos indices de reciclado para el PET.

PHA es el termino general para una gama de diversos polimeros biodegradables que consisten en poliesteres de acidos (R) -3-hidroxialcanoicos. Estos polimeros son de interes debido a una amplia gama de aplicaciones y al hecho de que son completamente biodegradables, ofreciendo asi problemas de residuos escasos o no a largo plazo.

Estos polimeros pueden se acumulados por algunas bacterias intracelularmente como materiales de almacenamiento de carbono. Se ha observado que la acumulaci6n de PHA se produce en bacterias en respuesta a una gama de factores de estres ambiental tales como limitaci6n de nutrientes inorganicos. Los sustratos que se suministran a las bacterias para acumular PHA se dividen en dos grupos 1) sustancias relacionadas con PHA, es decir, acidos alcanoicos (acidos grasos) que se asemejan a los mon6meros que constituyen los PHA (acidos (R) -3hidroxialcanoicos) y 2) sustratos no relacionados con PHA, que son sustratos que no se asemejan a los mon6meros que constituyen los PHA, p. ej. glucosa.

Un objetivo de la invenci6n es mitigar o eliminar las desventajas asociadas con el reciclado de PET.

Tambien es un objetivo de la invenci6n proporcionar un metodo para producir PHA a partir del producto de degradaci6n de PET, a saber acido tereftalico y/o una sal del mismo y/o un ester del mismo.

Oe acuerdo con la invenci6n, se proporciona un metodo para producir polihidroxialcanoato (PHA) , que comprende (i) cultivar en un medio de cultivo que comprende acido tereftalico y/o una sal del mismo y/o un ester del mismo una o mas cepas bacterianas que son capaces de acumular PHA a partir de acido tereftalico o una sal o un ester del mismo y que se seleccionan de la cepa GO16 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41538, la cepa GO19 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41537 y la cepa GO23 de Pseudomonas frederiksbergensis que tiene el numero de registro NCIMB 41539; y (ii) recuperar el PHA producido del medio de cultivo.

La invenci6n tambien proporciona la cepa GO16 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41538. La secuencia de rONA de 16S de la cepa G016, presentada en el N° IO SEC 1, comparte 99% de homologia con una cepa de Pseudomonas putida conocida (OQ 133506, vease la Tabla 2) .

La invenci6n proporciona ademas la cepa GO19 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41537. La secuencia de rONA de 16S de la cepa G019, presentada en el N° IO SEC 2, comparte 99% de homologia 45 con una cepa de Pseudomonas putida conocida (AY512611, vease la Tabla 2) .

La invenci6n proporciona ademas la cepa de Pseudomonas frederiksbergensis G023 que tiene el numero de registro NCIMB 41539. La secuencia de rONA de 16S de la cepa G023, presentada en el N° IO SEC 3, comparte 99% de homologia con una cepa de Pseudomonas frederiksbergensis conocida (AJ249382, vease la Tabla 2) .

Cada una de las cepas G016 de Pseudomonas putida, cepa G019 de Pseudomonas putida y cepa G023 de 50 Pseudomonas frederiksbergensis es capaz de acumular PHA a partir de acido tereftalico o una sal o un ester del mismo.

Segun se describe con mas detalle en el Ejemplo 1 (A) posteriormente, la secuencia de bases de rONA de 16S de cada una de las cepas de la invenci6n se analiz6 e identific6 usando el programa BLAST de la base de datos del GenBank NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) , y cada una de las cepas se deposit6 el 24 de enero de 2008 en la instituci6n depositaria NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Escocia, una autoridad depositaria internacional bajo el Tratado de Budapest.

El PHA recuperado del medio de cultivo comprende ventajosamente al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, mas preferiblemente al menos 90%, lo mas preferiblemente al menos 95% de PHA de longitud de cadena media (mcl) . El mclPHA se clasifica segun comprenda unidades repetitivas derivadas de mon6meros de acido 3hidroxialcanoico que contienen 6 atomos de carbono (C6) a 14 atomos de carbono (C14) . Preferiblemente, al menos 80%, mas preferiblemente 85%, aun mas preferiblemente al menos 90%, lo mas preferiblemente al menos 95% del mclPHA comprende unidades repetitivas de mon6meros C8, C10 y C12. Mas preferiblemente, el mclPHA comprende unidades repetitivas en una cantidad en peso respectiva de mclPHA de 15%-25% de C8, 40%-50% de C10 y 30%-40% de C12, preferiblemente segun se determina usando un cromat6grafo de gases (GC) de la serie Agilent 6890N equipado con una columna BP-21 de 30 m x 0, 25 mm x 0, 2 !m (J & W Scientific) , y mas preferiblemente segun se confirma usando un GC Agilent 6890N equipado con un espectrofot6metro de masas inerte de la serie 5973, usando una columna HP-1 de 12 m x 0, 2 mm x 0, 33 !m (Hewlett-Packard) . En una realizaci6n preferida, la cantidad de C8, C10 y C12 totaliza 100%.

Los PHA se clasifican generalmente como PHA de longitud de cadena corta (sclPHA) , PHA de longitud de cadena media (mclPHA) o PHA de longitud de cadena larga (lclPHA) , dependiendo del numero de atomos de carbono de los mon6meros constituyentes de los mismos. El sclPHA comprende mon6meros de C3-C5, el mclPHA comprende mon6meros de C6-C14 y el lclPHA comprende mon6meros de mas de 14 carbonos (> C14) . Esta variaci6n en la longitud de cadena del mon6mero da lugar a diferentes propiedades en el polimero, teniendo tanto los sclPHA como los IclPHA propiedades no deseables, teniendo los sclPHA un alto grado de cristalinidad y siendo rigidos y fragiles, y siendo los lclPHA pegajosos y muy dificiles de manejar. Las propiedades de los sclPHA y lclPHA limitan la gama de sus aplicaciones. Los mclPHA, segun se producen mediante el metodo de la invenci6n, y que pueden comprender mon6meros seleccionados de mon6meros C6, C8, C10, C12 y C14, tienen propiedades mucho mas deseables, siendo elast6meros con una baja temperatura de transici6n vitrea y teniendo propiedades que son adecuadas para una amplia gama de aplicaciones incluyendo caucho biodegradable y materiales de revestimiento. Por lo tanto, la producci6n de mclPHA de acuerdo con la invenci6n proporciona ventajosamente un polimero que tiene una amplia gama de aplicaciones y es biodegradable.

Sales de acido tereftalico utiles en la invenci6n incluyen sales de metales alcalinos y metales alcalinoterreos y mezclas de las mismas, tales como sales s6dicas y potasicas, y sales magnesicas, calcicas y baricas. Se prefieren sales mono- o di-s6dicas o potasicas de acido tereftalico. El tereftalato monos6dico se prefiere especialmente. En una realizaci6n especialmente preferida, el acido tereftalico o la sal o el ester del mismo esta en la forma de tereftalato monos6dico, tambien denominado en la presente memoria tereftalato s6dico o acido tereftalico (sal s6dica) .

Esteres de acido tereftalico que pueden usarse en la invenci6n incluyen mono- y di-esteres de acido tereftalico y mezclas de los... [Seguir leyendo]

1. Un metodo para producir polihidroxialcanoato (PHA) , que comprende (i) cultivar en un medio de cultivo que comprende acido tereftalico y/o una sal del mismo y/o un ester del mismo una o mas cepas bacterianas que son capaces de acumular PHA a partir de acido tereftalico o una sal o un ester del mismo y que se seleccionan de la cepa GO16 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41538, la cepa GO19 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41537 y la cepa GO23 de Pseudomonas frederiksbergensis que tiene el numero de registro NCIMB 41539; y (ii) recuperar el PHA producido del medio de cultivo.

2. Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que el medio de cultivo comprende la cepa G019 y/o la cepa G016.

3. Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2, en el que el PHA recuperado del medio de cultivo comprende al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, mas preferiblemente al menos 90%, lo mas preferiblemente al menos 95% de PHA de longitud de cadena media (mcl) .

4. Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 3, en el que al menos 80%, preferiblemente 85%, mas preferiblemente al menos 90%, aun mas preferiblemente al menos 95% del mclPHA comprende unidades repetitivas de mon6meros C8, C10 y C12.

5. Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en el que el mclPHA comprende unidades repetitivas de mon6meros C8, C10 y C12 en una cantidad en peso respectiva de mclPHA d.

15. 25% de C8.

40. 50% de C10 .

30. 40% de C12.

6. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en el que una sal de acido tereftalico esta presente en el medio de cultivo y en el que, preferiblemente, la sal se selecciona de sales de metales alcalinos y metales alcalinoterreos y mezclas de las mismas, especialmente sales s6dicas y potasicas, y sales magnesicas, calcicas y baricas.

7. Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 6, en el que la sal es una sal mono- o di-s6dica o potasica de acido tereftalico.

8. Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 7, en el que la sal es tereftalato monos6dico.

9. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en el que un ester de acido tereftalico esta presente en el medio de cultivo y en el que, preferiblemente, el ester se selecciona de mono- y di-esteres de acido tereftalico y mezclas de los mimos, especialmente mono- y di-esteres alquilicos C1-C4 y mono- y di-esteres glic6licos.

10. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en el que el acido tereftalico o la sal o ester del mismo puede obtenerse a partir de hidr6lisis o pir6lisis de poli (tereftalato de etileno) (PET) , preferiblemente pir6lisis de PET.

11. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en donde el metodo comprende cultivar la una o mas cepas en el medio de cultivo durante un periodo de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horas, preferiblemente de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 60 horas, mas preferiblemente aproximadamente 48 horas, a una temperatura de aproximadamente 25'C a aproximadamente 35'C, preferiblemente aproximadamente 30'C.

12. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en el que el medio de cultivo esta limitado en nitr6geno, con un contenido maximo de nitr6geno de aproximadamente 0, 5 g/l, preferiblemente 0, 067 g/l de medio de cultivo.

13. la cepa GO16 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41538.

14. la cepa GO19 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41537.

15. la cepa GO23 de Pseudomonas frederiksbergensis que tiene el numero de registro NCIMB 41539.

Figura 2 Figura 3