PROTEINAS QUIMERICAS DEL FACTOR DE COAGULACION FC PARA TRATAR LA HEMOFILIA.

Una proteína quimérica que comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina,

al menos un factor de coagulación seleccionado del grupo que consiste del factor VIII, factor VIIIa, factor V, factor Va, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII o factor de von Willebrand, y opcionalmente al menos un ligador

Proteínas quiméricas del factor de coagulación Fc para tratar la hemofilia.

Esta aplicación reivindica de prioridad a la United States Provisional Appln. No. 60/468,837, archivada en Mayo 6, 2003.

Campo de la invención

La invención se relaciona generalmente con el campo de terapéuticos para desórdenes hemostáticos. Más específicamente, la invención se relaciona con una proteína quimérica para el tratamiento de un trastorno hemostático.

Antecedentes de la invención

Los trastornos hemostáticos se caracterizan por sangrado no controlado, que resulta en la incapacidad o capacidad reducida para formar coágulos de fibrina. Los trastornos hemostáticos pueden resultar de un defecto genético o se pueden adquirir como un resultado de una condición médica no relacionada (por ejemplo, cáncer y quimioterapia relacionada, enfermedad autoinmune) (Kasper 2000, Hemophilia 6(Supp):13; Cohen et al. 1996, Bailiere's Clinical Hematology 9(2):331). Por lo general, los trastornos hemostáticos resultan de la deficiencia de un factor de coagulación de la sangre específico. Ejemplos clásicos de trastornos hemostáticos incluyen hemofilia A, que resulta de una deficiencia en el factor VIII; hemofilia B (enfermedad de Christmas), que resulta de una deficiencia en el factor IX; y la enfermedad de von Willebrand, que resulta en un defecto en el factor de von Willebrand. El factor de von Willebrand circula en asociación con el factor VIII y lo estabiliza. Media la adherencia de las plaquetas entre sí y con las paredes de vasos sanguíneos lesionadas. Otros, trastornos hemostáticos menos comunes incluyen deficiencia del factor XI (deficiencia de PTA), deficiencia del factor XII, así como deficiencias o anormalidades estructurales en fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X, o factor XIII (Kasper 2000, Hemophilia 6(Supp):13).

Los factores de coagulación actúan en concierto con otros, en una cascada de coagulación que finalmente resulta en la formación de un coágulo de fibrina (Figura 1). Estos factores pueden existir en un estado de reposo como una proenzima o zimógeno o en un estado enzimático activo cuando se estimula para formar un coágulo. La estimulación de estos factores, puede ocurrir por dos rutas distintas, la ruta intrínseca y la ruta extrínseca. La ruta intrínseca se refiere a aquellas reacciones que conducen a la formación de coágulos mediante el uso de factores presentes solo en el plasma. En contraste, la ruta extrínseca se refiere a aquellas reacciones que conducen a la formación de coágulos de la liberación de factor de tejido de enlace de membrana por la interrupción del endotelio del vaso.

El factor VII participa en ambas rutas que dividen el factor X en el factor Xa activado en relación con el factor tisular en la ruta extrínseca o que interactúa con el factor IXa en la ruta intrínseca. El factor VII actúa secuencia abajo e independientemente de los factores VIII y IX cuando actúa a través de la ruta extrínseca, evitando así la necesidad de estos factores de coagulación. Es, por lo tanto, un candidato terapéutico atractivo para tratar trastornos hemostáticos, especialmente Hemofilia A y B. (U.S. Patent No. 6,310,183; WO 01/58935).

El factor VII, es una proteína de plasma dependiente de la vitamina K, sintetizada en el hígado y segregada en la sangre como una glicoproteína de cadena sencilla con un peso molecular de 53 kDa (Broze et al. 1980, J. Biol. Chem. 255:1242). El zimógeno del factor VII se convierte en una forma activa (FVIIa) por división proteolítica en un sitio único, Arg152-Ile153, resultando en dos cadenas, pesada (254 aminoácidos) y ligera (154 aminoácidos) unidas por un enlace disulfuro sencillo (Hagen et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83:2412). La forma activa del factor VII se une al factor tisular, el cual luego se convierte de factor X a factor Xa. El factor Xa se necesita para convertir la protrombina a trombina, que convierte el fibrinógeno a fibrina como una etapa final para formar un coágulo de fibrina.

El factor VII experimenta modificaciones pos-translacionales, incluyendo la carboxilación dependiente de la vitamina K, que resulta en diez residuos de ácido ?-carboxiglutámico en la región terminal-N de la molécula. Otras modificaciones pos-translacionales incluyen unión de la fracción de azúcar a dos sitios de glicosilación N-ligados que ocurren naturalmente en la posición 145 y 322, respectivamente, y en dos sitios de glicosilación O-ligados que ocurren naturalmente en la posición 52 y 60, respectivamente (WO 01/58935).

La terapia tradicional para trastornos hemostáticos denominada para reemplazo parenteral de diferentes factores de coagulación tales como factor VII, factor VIII o factor IX (ver, por ejemplo, U.S. Patent Nos. 6,310,183 y 4,784,950). El tratamiento con frecuencia implica tanto la administración de factores de coagulación para tratar episodios de sangrado agudos, así como la administración de factores de coagulación para impedir profilácticamente la ocurrencia de futuros episodios de sangrado. Se ha encontrado que la profilaxis reduce el riesgo del desarrollo de problemas de articulaciones y artritis asociados con episodios de sangrado frecuentes (Petrini 2001, Hemophilia 7:99; Fischer et al. 2002, Blood 99(7):2337).

Las terapias tradicionales, sin embargo, tienen muchos problemas asociados. En la actualidad, los factores de coagulación se deben administrar vía parenteral con el fin de lograr dosis efectivas debido a que hasta la fecha, los métodos no-invasivos no han tenido éxito en alcanzar niveles terapéuticos. Los problemas asociados con la administración parenteral incluyen oclusión, dolor e infección de sitio de inyección. El uso de un catéter en-línea aumenta el riesgo de todos estos eventos. Problemas específicos asociados con la administración parenteral de factores de coagulación en bebés y niños pequeños incluyen el acceso venoso central. Adicionalmente, la administración parenteral de factores de coagulación corre el riesgo de precipitar un episodio de sangrado. Estos problemas son particularmente relevantes cuando el paciente está experimentando la administración profiláctica regular de un factor de coagulación.

Los factores de coagulación, tales como factor IX y factor VIII deben darse con frecuencia y en grandes dosis, lo que da lugar al desarrollo de anticuerpos del inhibidor contra el factor de coagulación en un número significante de pacientes (ver, por ejemplo, Nilsson 1992, Transfusion Medicine Review 6(4):285; Cohen et al. 1996, Bailiere's Clinical Hematology 9(2):331).

Un aspecto de la invención proporciona un tratamiento seguro más efectivo para trastornos hemostáticos. Otro aspecto de la invención proporciona el aumento de la vida media del suero y el incremento de la biodisponibilidad de terapéuticos administrados a través de medios no-invasivos para el tratamiento de trastornos hemostáticos, reduciendo así el riesgo de que suceda un episodio de sangrado, infección y oclusión del sitio de inyección asociado con la administración parenteral. Otro aspecto de la invención proporciona la terapia para los trastornos hemostáticos con un riesgo reducido, en comparación con las terapias actuales, de desarrollo de anticuerpos del inhibidor contra el factor de coagulación. Incluso otro aspecto de la invención proporciona un tratamiento profiláctico de un trastorno hemostático.

Los aspectos de la invención proporcionan una proteína quimérica compuesta de al menos un factor de coagulación y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, en donde el factor de coagulación es capaz de promover la coagulación de la sangre y/o la formación del coágulo de fibrina.

Las proteínas quiméricas que comprenden una porción Fc de una inmunoglobulina se conocen (ver, por ejemplo, U. S. Patent Nos. 6,030,613, 6,086,875, 6,485,726, y PCT Application No. US/02/21335) y mientras que las proteínas quiméricas compuestas de factores de coagulación mutantes sin actividad de coagulación, y las inmunoglobulinas se han descrito previamente (WO01/02439 y WO 01/02240), las proteínas quiméricas que comprenden un factor de coagulación (i.e., que tiene la actividad de coagulación) y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina se han descrito solo para la tromboplastina (EP 0 464 533). El factor de coagulación según se define a continuación y se emplea aquí se refiere a cualquier molécula con actividad de coagulación tal como se define en este documento.

Resumen de la invención

La invención...

1. Una proteína quimérica que comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, al menos un factor de coagulación seleccionado del grupo que consiste del factor VIII, factor VIIIa, factor V, factor Va, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII o factor de von Willebrand, y opcionalmente al menos un ligador.

2. La proteína quimérica de la reivindicación 1, en donde dicha inmunoglobulina es una IgG.

3. La proteína quimérica de la reivindicación 2, en donde la porción de una región constante de inmunoglobulina es un fragmento Fc.

4. La proteína quimérica de la reivindicación 2, en donde la porción de una región constante de inmunoglobulina es un socio de enlace FcRn.

5. La proteína quimérica de la reivindicación 2, en donde el fragmento Fc comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 80% de identidad con la secuencia enunciada en SEQ ID NO:2.

6. La proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, en donde el factor de coagulación es el factor IX.

7. Una composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica de la reivindicación 1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

8. La proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, en donde dicha proteína quimérica es un dímero.

9. La proteína quimérica de la reivindicación 8, en donde el dímero es un homodímero.

10. Una proteína quimérica que comprende un dímero que comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde dicha primera cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina y Factor VII o Factor VIIa y dicha segunda cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina sin el factor VII o factor VIIa.

11. La proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, que comprende la fórmula

X-L-F

en donde F es un fragmento Fc de una inmunoglobulina y L es un ligador o un enlace directo, y X se selecciona del grupo que consiste del factor VIII, factor VIIIa, factor V, factor Va, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII o factor de von Willebrand.

12. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde F comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 80% de identidad con la secuencia de aminoácido enunciada en SEQ ID NO:2.

13. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde L es un ligador que comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos.

14. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde L es un ligador que comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos.

15. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde L es un ligador que comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 5 aminoácidos.

16. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde L es un ligador que comprende la secuencia - (Gly)_n-, en donde n es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.

17. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde L es un ligador que comprende la secuencia - (GGS)_n- o (GGGGS)_n, en donde n es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.

18. La proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, en donde la proteína quimérica promueve la hemostasis.

19. El uso de una cantidad efectiva terapéuticamente de la proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4 en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno hemostático.

20. El uso de la reivindicación 19, en donde el trastorno hemostático es la hemofilia A o B.

21. El uso de la reivindicación 19, en donde el factor de coagulación es el factor IX.

22. El uso de la reivindicación 19, en donde el medicamento se formula para la administración vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, o vía una superficie de mucosa.

23. El uso de la reivindicación 22, en donde el medicamento se formula para la administración vía oral, nasal, rectal, vaginal, o administración vía bucal.

24. El uso de la reivindicación 22, en donde el medicamento se formula para la administración vía una ruta pulmonar.

25. El uso de la reivindicación 19, en donde el medicamento se formula para la administración no-parenteral.

26. El uso de la reivindicación 19, en donde el medicamento se formula para la administración en una dosis de 0.1-1000 µg/kg.

27. El uso de la reivindicación 19, en donde el medicamento se formula para la administración diaria.

28. Un método para hacer una proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, dicho método que comprende:

a) transfección de una célula con una construcción de ADN que comprende una primera secuencia de ADN que codifica al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina ligada operativamente a una segunda secuencia de ADN que codifica un factor de coagulación y opcionalmente una tercera secuencia de ADN que codifica una endoproteasa;

b) cultivo de dicha célula bajo condiciones, de tal manera que la proteína quimérica se exprese; y

c) aislamiento de dicha proteína quimérica a partir de dicha célula.

29. El método de la reivindicación 28, en donde las condiciones de cultivo incluyen vitamina K.

30. El método de la reivindicación 29, en donde la endoproteasa es PACE.

31. El método de la reivindicación 28, en donde la célula es una célula eucariota.

32. El método de la reivindicación 31, en donde la célula es una célula CHO o una célula BHK.

33. El método de la reivindicación 28 que además comprende la transfección de una célula con una segunda construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina sin dicha segunda secuencia que codifica un factor de coagulación.

34. El método de la reivindicación 28 o 33, en donde dicha porción de una región constante de inmunoglobulina es un fragmento Fc.

35. El método de la reivindicación 28 o 33, en donde dicha porción de una región constante de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG.

36. El método de la reivindicación 28 o 33, en donde dicha porción de una región constante de inmunoglobulina es un socio de enlace FcRn.

37. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4.

38. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 37.

39. El vector de la reivindicación 38, en donde el factor de coagulación es el factor IX.

40. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 38.

41. La célula huésped de la reivindicación 40, en donde dicha célula huésped es una célula CHO o una célula BHK.

42. La proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2.

43. El vector de la reivindicación 39, que comprende la secuencia de ADN de SEQ ID NO:3.

44. El uso de al menos una proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4 en combinación con cualquier agente conocido que tenga actividad del factor de coagulación en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno hemostático.

45. El uso de la reivindicación 44 en donde dicho segundo agente es el factor VIII, factor IX, factor XI, factor XII, fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X, factor XIII o factor de von Willebrand.

46. La proteína quimérica de la reivindicación 8, en donde la proteína quimérica es un dímero que comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde dicha primera cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina y el Factor VIII y dicha segunda cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina sin el factor VIII.

47. La proteína quimérica de la reivindicación 8, en donde la proteína quimérica es un dímero que comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde dicha primera cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina y el Factor IX y dicha segunda cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina sin el factor IX.