Procedimiento que permite producir modificaciones múltiples en el cromosoma de bacterias Gram negativas y cepas de salmonella deficientes en síntesis de c-di-GMP obtenidas por el mismo.

El procedimiento permite realizar múltiples modificaciones en el genoma de bacterias Gram negativas de forma sencilla y eficaz, utilizando los plásmidos de la invención, que contienen un gen indicador bajo el control de un promotor constitutivo, un origen de replicación específico para bacterias Gram negativas, un gen que codifica una proteína termosensible esencial para la iniciación de la replicación del plásmido, convirtiendo el origen de replicación en termosensible, y un gen de contra-selección. La invención se refiere también a cepas mutantes de Salmonella enterica obtenidas mediante el procedimiento de la invención en las que parte o los doce genes que codifican proteínas con dominio GGDEF han sido delecionados y al uso de las mismas como vectores de expresión, agentes inmunoterapéuticos y en estudios metabólicos

Procedimiento que permite producir modificaciones múltiples en el cromosoma de bacterias Gram negativas y cepas de Salmonella deficientes en síntesis de c-di-GMP obtenidas por el mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para realizar modificaciones en el genoma de una bacteria Gram negativa que permite realizar múltiples modificaciones sucesivas sobre una misma cepa bacteriana de forma sencilla y eficaz, así como a los plásmidos que permiten llevar a cabo dicho procedimiento. La invención se refiere también a dos cepas mutantes de Salmonella enterica obtenidas mediante el procedimiento de la invención en las que los doce genes que codifican proteínas con dominio GGDEF han sido delecionados (mutante ?XII::Km y mutante ?XII::Clo) y a cepas derivadas de las anteriores, o de las cepas intermedias utilizadas para su obtención, que son capaces de expresar una única proteína GGDEF funcional, así como a los posibles usos de las mencionadas cepas mutantes de Salmonella.

Estado de la técnica

Las proteínas GGDEF y el c-di-GMP

La primera asociación entre el c-di-GMP y las proteínas GGDEF se realizó durante el estudio de la síntesis de celulosa en Gluconacetobacter xylinus (anteriormente denominada Acetobacter xylinum). Un artículo pionero publicado por el grupo de Moshed Benziman (Christensen, 1987) demostró que la actividad de la subunidad reguladora de la celulosa sintetasa se activaba tras la unión del dinucleótido cíclico di-guanidin-monofosfato cíclico, c-di-GMP (Fig. 1). Este trabajo pasó desapercibido hasta que 11 años más tarde, este mismo grupo proporcionó la primera conexión entre la síntesis/degradación del c-di-GMP y las proteínas con dominios GGDEF (dominio relacionado con la actividad diguanilato ciclasa, es decir, con la síntesis de c-di-GMP) y/o EAL (dominio relacionado con la actividad fosfodiesterasa, es decir, con la degradación del c-di-GMP y que puede encontrarse aislado en un polipéptido o combinado con el dominio GGDEF sobre la misma proteína). Mediante genética reversa y utilizando la secuencia de aminoácidos de las proteínas con actividad diguanilato ciclasa y fosfodiesterasa purificadas, Tal et al. (Tal et al., 1998) clonaron y caracterizaron tres operones implicados en el control de los niveles de c-di-GMP en G. xylinus. Cada uno de estos operones incluía dos genes, un gen que codificaba una proteína con actividad diguanilato ciclasa, responsable de la síntesis de c-di-GMP a partir de dos moléculas de GTP y un gen que codificaba una fosfodiesterasa, responsable de la degradación del c-di-GMP a GMP. El análisis de las secuencias de estas enzimas reveló que las seis proteínas parálogas codificadas por estos tres operones tenían en común la presencia de dos dominios, a los que se denominó GGDEF (anteriormente DUF1, Domain of Unknown Function 1) y EAL (anteriormente DUF2), debido a la presencia muy conservada de estas secuencias de aminoácidos en cada uno de ellos. En base a estos resultados, el grupo de M. Benziman propuso un modelo de regulación de la síntesis de celulosa en el que proteínas con dominio GGDEF serían responsables de la síntesis de c-di-GMP mientras que las proteínas con dominio EAL serían responsables de la degradación del c-di-GMP. El c-di-GMP se uniría a la subunidad catalítica de la celulosa sintetasa activando de forma alostérica la síntesis de la celulosa.

La reciente secuenciación de los genomas bacterianos ha puesto de manifiesto que el dominio GGDEF es extremadamente abundante, pudiendo contabilizarse hasta 4200 proteínas con dominio GGDEF en las bases de datos. A pesar de su abundancia, la presencia de las proteínas con dominio GGDEF está restringida a las bacterias y no se ha encontrado ninguna proteína con este dominio en Arqueas o Eucariotas (Galperin, 2004). Dentro de las bacterias, existen proteínas GGDEF en la mayoría de los genomas secuenciados desde Aquifex y Thermotoga hasta las a y ? Proteobacterias. El dominio GGDEF está ausente de los genomas de Bacteroidetes, Chiamidiales y Fusobacteria. La abundancia de proteínas conteniendo este dominio es muy variable entre las distintas especies bacterianas. Así, el genoma de Escherichia coli contiene 19 proteínas con dominio GGDEF, el genoma de Pseudomonas aeruginosa contiene 39 proteínas con dominio GGDEF, Bacillus subtilis tiene 4, y el pequeño genoma de Rickettsia prowazekii contiene una única proteína GGDEF. La bacteria con mayor número de proteínas GGDEF es Vibrio vulnificus cuyo genoma contiene 66 proteínas con dominio GGDEF.

Uno de los aspectos más llamativos de las proteínas GGDEF es que, a pesar de su abundancia, la inmensa mayoría de estas proteínas no ha sido relacionada con ninguna función biológica. Así, hasta muy recientemente, ninguna de las 19 proteínas con dominio GGDEF de E. coli se había relacionado con alguna función biológica. Una situación similar ocurre con las 39 proteínas del genoma de Pseudomonas aeruginosa o con las 41 proteínas del genoma de Vibrio cholerae. Tras este letargo, en los últimos tres años y coincidiendo con el estudio exhaustivo del proceso de formación de biofilms, se han descrito numerosas proteínas con dominio GGDEF implicadas en distintos procesos bacterianos, incluyendo la síntesis de exopolisacáridos y formación del biofilm, procesos de diferenciación en Caulobacter crescentus, virulencia de patógenos animales y de plantas y regulación de genes implicados en fotosíntesis en Synechococcus elongatus (para revisión consultar (Romling et al., 2005, Ryan et al., 2006, Jenal & Malone, 2006, Tamayo et al., 2007)). De forma general, se ha observado que niveles elevados de c-di-GMP están asociados con una mayor capacidad de la bacteria para adherirse a un sustrato (sesilidad), la formación de biofilm y la expresión de componentes adhesivos de la matriz extracelular, mientras que niveles bajos de c-di-GMP se han relacionado con una mayor motilidad y virulencia.

De forma general, y apoyados en el hecho de que el dominio GGDEF suele estar con frecuencia acompañado de otros dominios sensores (PAS, PAC, MASE2, HAMP), se ha sugerido que las proteínas GGDEF podrían ser miembros de una red de transducción de señal que permitiría adecuar la respuesta a estímulos externos mediante la producción del transmisor secundario de señal, el c-di-GMP. La pregunta que surge inmediatamente es cómo diferentes estímulos pueden dar lugar a respuestas particulares, si todos ellos convergen en la producción de una misma molécula difusible, el c-di-GMP, para transmitir la señal.

La abundancia de proteínas implicadas en la síntesis de c-di-GMP en los genomas bacterianos, y el hecho de que su presencia esté exclusivamente restringida al dominio Bacteria, no habiéndose descrito la presencia de proteínas GGDEF en ningún genoma eucariota, ni en ningún genoma de Arqueas hasta ahora secuenciados, convierten a este mensajero de señal y a su ruta de señalización en una diana interesante para el desarrollo de sustancias que bloqueen su síntesis y, en consecuencia, la capacidad de formar biofilms, adherirse a superficies o la virulencia de las bacterias.

Las infecciones causadas por las bacterias del género Salmonella, tanto en animales como en seres humanos, han sido causa de gran preocupación durante bastantes años. El desarrollo de cepas atenuadas de Salmonella para generar con ellas protección frente a las enfermedades causadas por las bacterias de este género ha suscitado gran interés entre los investigadores, que han intentado averiguar los factores de patogenicidad de estas bacterias para intentar combatirlos. Entre otros, la formación de biofilm es un importante factor de patogenicidad de Salmonella, ya que le permite sobrevivir en ambientes fuera del huésped, incluyendo el suelo y el agua, y así pasar con facilidad del aparato digestivo del huésped al ambiente y viceversa. La capacidad de formación de biofilms parece estar ampliamente extendida entre los serotipos de Salmonella enterica (una de las principales especies que da lugar a infecciones intestinales) y, particularmente, entre los serotipos Enteritidis (al que se hará referencia de aquí en adelante como S. Enteritidis) y Typhimurium (al que se hará referencia de aquí en adelante como S. Typhimurium).

Debido a su influencia en la patogenicidad y virulencia, los factores que influyen sobre la capacidad de formación de biofilms por parte de las especies de Salmonella y otras especies...

1. Una cepa mutante de Salmonella spp. en la que se han delecionado todos : los genes que codifican las proteínas GGDEF.

2. Cepa mutante según la reivindicación 1, que es una cepa mutante del serotipo Enteritidis de Salmonella enterica.

3. Cepa mutante según la reivindicación 2, que es el mutante ?XII::Km o el mutante ?XII::Clo.

4. Uso de una cepa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como intermedio para la obtención de cepas mutantes en las que reinserta uno o más genes que codifican proteínas GGDEF.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que la cepa mutante es el mutante ?XII::Km o el mutante ?XII::Clo.

6. Uso de una cepa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento destinado a ser utilizado como vacuna.

7. Uso de una cepa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como vector de expresión de antígenos de cualquier organismo (xenoantígenos).

8. Uso de una cepa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como vector de expresión de un fármaco.

9. Una cepa mutante de Salmonella spp. en la que se ha delecionado al menos uno de los genes que codifica para proteinas GGDEF.

10. Cepa según la reivindicación 9, que es una cepa mutante del setoripo Enteritidis de Salmonella enterica.

11. Cepa según la reivindicación 10, que se selecciona del grupo de las cepas ?I, ?II, ?III, ?IV, ?V, ?VI, ?VII, ?VIII, ?IX, ?X, ?XI.

12. Cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que se ha reinsertado uno de los genes que codifica para proteína GGDEF previamente delecionado.

13. Cepa según una cualquier de las reivindicaciones 9 a 12, en cuya genoma está presente únicamente un gen funcional que codifica para proteínas GGDEF a partir del cual se expresa una proteína GGDEF funcional.

14. Cepa según la reivindicación 13, que se ha generado reinsertando en el mutante ?XII::Km uno de los genes que codifica para proteínas GGDEF previamente delecionado.

15. Cepa según la reivindicación 14, que es la cepa S. Enteritidis 3934 AXII+stm 1987.

16. Cepa según la reivindicación 13, que es la cepa S. Enteritidis 3934 ?XII+stm4551.

17. Uso de una cepa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 para la fabricación de un medicamento destinado a ser utilizado como vacuna.

18. Uso de una cepa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 como vector de expresión de antígenos de cualquier organismo (xenoantígenos).

19. Uso de una cepa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 como vector de expresión de un fármaco en el interior de células diana con fines terapeúticos.

20. Uso de una cepa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 para el estudio del metabolismo del c-di-GMP.

21. Uso según la reivindicación 20 para la identificación y desarrollo de sustancias químicas que bloqueen la síntesis de c-di-GMP.

22. Uso según la reivindicación 20 ó 21, en el que la cepa mutante es una cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16.

23. Uso de una cepa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, para el estudio de los mecanismos de formación y/o bloqueo de la formación de biofilms.

24. Uso de una cepa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 para el estudio de la relación de los biofilms con la virulencia.