Cepa viva atenuada de Salmonella enterica serovar Choleraesuis como vacuna y vehículo vacunal para el ganado porcino.

La presente invención proporciona una nueva cepa vacunal viva y atenuada, incapaz de producir el factor alternativo sigma (RpoS) y que, además, funciona como vehículo vacunal de antigenos heterólogos. La construcción de la cepa se ha realizado mediante la deleción en fase de la totalidad del gen que codifica el factor alternativo sigma, rpoS, mediante doble recombinación homóloga. La cepa es avirulenta, genéticamente estable, sin marcadores de resistencia antibiótica y se diferencia fácilmente de las cepas silvestres

Cepa viva atenuada de Salmonella enterica serovar Choleraesuis como vacuna y vehículo vacunal para el ganado porcino.

Campo técnico

La presente invención se encuadra dentro del campo de la Sanidad Animal. De forma más concreta, la invención se refiere a la producción de una cepa viva de Salmonella enterica serovar Choleraesuis (S. choleraesuis) atenuada mediante la deleción de un gen, genéticamente estable y sin marcadores de resistencia a antibióticos. Constituye una nueva cepa vacunal frente a salmonelosis en porcino y un nuevo vehículo vacunal frente a enfermedades del cerdo.

Estado de la técnica

Salmonella es un patógeno intracelular que puede ocasionar gastroenteritis, fiebre entérica o bacteriemia tanto en animales como en el hombre. Las bacterias del género Salmonella son bacilos móviles, Gram negativos, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae y se encuentran filogenéticamente próximas a los géneros Escherichia, Shigella y Citrobacter.

En cuanto a su taxonomía, es importante destacar la falta de unanimidad a la hora de denominar a las especies de Salmonella y la notable confusión existente con los nombres S. choleraesuis y S. enterica.

En 1980 se aprobó el nombre de S. choleraesuis como único nombre de especie y con varias subespecies; por otro lado, en 1987, se propuso que la única especie del género se llamara S. enterica por ser S. choleraesuis un término confuso al pertenecer también a uno de los numerosos serovares que integran el género Salmonella; al mismo tiempo, otros autores reconocían varias especies, y entre ellas S. choleraesuis, mientras que, en 2000, la única especie de Salmonella reconocida por el Código Bacteriológico era S. choleraesuis. En resumen, ha habido durante mucho tiempo una propuesta acorde al Código Bacteriológico que iba cayendo en desuso (S. choleraesuis); y una propuesta ilegítima que se iba utilizando cada vez más (S. enterica).

Por fin, en 2005, la Comisión Judicial del Comité Internacional de Sistemática de Procariotas decidió que el género Salmonella está formado por tres especies: S. enterica, S. bongori y S. subterranea, y entre los numerosos serovares de la especie S. enterica, se encuentra S. enterica serovar Choleraesuis (Tindall, et al., 2005, Int J Syst Evol Microbiol, 55: 521-4; Shelobolina, et al., 2004, Appl Environ Microbiol, 70: 2959-65; Euzéby, 2005, Int J Syst Evol Microbiol, 55: 547-9).

Debido a esta confusión, muchos de los documentos anteriores a 2005 en los que se cita a S. choleraesuis no se refieren a este serovar en concreto sino a la especie tipo tal y como se denominaba anteriormente y que ahora es S. enterica.

El tipo de enfermedad causada por Salmonella depende del serovar y del hospedador implicados, por lo que una clasificación práctica de serovares se basa en su espectro de hospedador. Siguiendo este criterio, los serovares de Salmonella se dividen en tres grupos: de hospedador restringido, se asocian casi exclusivamente con un hospedador concreto (como Typhi -humanos-, Abortusequi -caballos-, o Abortusovis -ovejas-); adaptados a un hospedador, se asocian principalmente con una especie aunque también pueden causar enfermedades en otras (como Dublin -ganado vacuno- y Choleraesuis -cerdos-); de hospedador no restringido, son ubicuos (como Typhimurium y Enteritidis) y pueden causar enfermedades en una amplia gama de hospedadores no relacionados.

La salmonelosis es una de las enfermedades entéricas y septicémicas con mayor importancia económica para la industria porcina y el serovar más frecuentemente aislado a partir de los animales afectados es Choleraesuis. La preocupación generalizada de las diversas administraciones por la elevada prevalencia de Salmonella en el sector porcino ha originado el establecimiento de una directiva europea (2003/99/CE) que obliga a este sector a aplicar medidas de vigilancia epidemiológica para controlar las infecciones por Salmonella a partir de enero de 2007.

Actualmente, existe una cepa vacunal frente a esta enfermedad, carente del plásmido de virulencia, (Enterisol SC-54) comercializada por Boehringer Ingelheim (patente US5436001) cuya utilización ha sido aprobada en EEUU y Alemania, pero no en otros países, como Taiwán, donde la incidencia de S. choleraesuis es enorme y no se ha aprobado el uso de la vacuna por problemas de seguridad (Ku, et al., 2005, Infect Immun, 73: 8194-203).

Debido, fundamentalmente, a la posibilidad de trabajar con el ratón como modelo experimental sencillo y económico, gran parte de los trabajos realizados en cuanto a la atenuación de las cepas de Salmonella se han basado en el serovar Typhimurium. Sin embargo, los expertos están de acuerdo en que los factores de virulencia no se pueden extrapolar de un serovar a otro y, mucho menos, de un hospedador a otro. Por eso, recientemente, se han abierto líneas de investigación que han dado lugar a cepas vacunales contra Salmonella para cerdos basadas en genes metabólicos (Kelly, et al., 1992, Infect Immun, 60: 4881-90) o a mutantes atenuados afectados en genes esenciales para la persistencia de Choleraesuis en cerdo (Ku, et al., 2005, Infect Immun, 73: 8194-203).

Por otro lado, se han utilizado bacterias invasivas vivas como vehículos vacunales de expresión de antígenos heterólogos (es decir, de antígenos procedentes de otros organismos) y entre las bacterias utilizadas se encuentran algunos casos del género Salmonella (Daudel, et al., 2007, Expert Rev Vaccines, 6: 97-110). Así, en la solicitud de patente US20030170211-A1, entre otras bacterias, se utiliza una cepa de S. typhi como sistema de liberación de ADN de alphavirus en células animales; la patente US5877159-A1 presenta bacterias invasivas vivas para expresar genes heterólogos en células animales mediante un casete de expresión eucariota y, entre las posibles bacterias invasivas, nombra a Salmonella; la patente US6764687-B1 se refiere a bacterias vivas atenuadas como vacunas que también pueden ser portadoras de genes heterólogos, construidas mediante la mutación del gen cra y, por lo tanto, por interferencia en el metabolismo de los carbohidratos, tanto de Escherichia como de Salmonella; en CN1730650 se describe una vacuna viva recombinante contra el virus de la fiebre aftosa construida en S. choleraesuis; US6905691-B1 hace referencia a bacterias atenuadas mediante la mutación del gen surA, acompañada o no de la mutación en otro gen, utilizadas como vacunas o como vehículos de expresión de antígenos heterólogos y, especialmente, de un fragmento de la toxina tetánica; WO9011687 se refiere a mutantes de Salmonella en el gen phoP o en el gen phoP y, simultáneamente, en los genes cya y crp que se emplean como vacunas o bien como portadores de antígenos de otros microorganismos patógenos.

Tanto la vacuna como el vehículo vacunal ideal deberían ser seguros, fuertemente inmunogénicos, bien caracterizados genéticamente y estables. Existe una necesidad urgente de desarrollar cepas que funcionen como vehículos vacunales, que ofrezcan un excelente perfil de seguridad y que sean capaces de estimular una respuesta celular efectiva.

Descripción de la invención

Un aspecto de esta invención se refiere a una cepa viva atenuada de Salmonella enterica serovar Choleraesuis construida mediante la mutación del regulador RpoS. Se considera cepa viva atenuada aquella estirpe que mantiene su capacidad de invadir y multiplicarse en el interior de su hospedador, pero sin desarrollar el cuadro patogénico. La nueva cepa ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Edificio de Investigación, 46100 Burjassot (Valencia) donde le ha sido asignado el número de depósito 7268. Se ha utilizado Salmonella enterica serovar Choleraesuis (según la nomenclatura vigente desde 2005) por ser un serovar que está especialmente adaptado al ganado porcino. Por comodidad, a partir de aquí la nombraremos como S. choleraesuis.

Si bien los mutantes en rpoS de S. typhimurium y de S. typhi son menos virulentos para el ratón y el hombre, respectivamente (Rychlik and Barrow, 2005, FEMS Microbiol Rev,...

1. Cepa viva atenuada de Salmonella enterica serovar Choleraesuis caracterizada porque carece de la actividad del regulador RpoS.

2. Cepa viva atenuada de S. enterica serovar Choleraesuis, según la reivindicación 1, caracterizada por la deleción del gen rpoS que codifica el regulador RpoS.

3. Cepa viva atenuada de S. enterica serovar Choleraesuis, según la reivindicación 2, caracterizada porque la deleción del gen rpoS es una deleción en fase.

4. Cepa viva atenuada de S. enterica serovar Choleraesuis, según la reivindicación 3, caracterizada porque la deleción en fase del gen rpoS se realiza mediante una estrategia que evita la reversión de la cepa mutada al fenotipo silvestre.

5. Cepa viva atenuada de S. enterica serovar Choleraesuis, según la reivindicación 4, caracterizada porque la estrategia elegida para evitar la reversión de la cepa mutada al fenotipo silvestre es la doble recombinación homóloga.

6. Cepa viva atenuada de S. enterica serovar Choleraesuis, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque la deleción de rpoS no deja en la bacteria marcadores de selección por resistencia a antibióticos.

7. Cepa viva atenuada de S. enterica serovar Choleraesuis, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque presenta mayor supervivencia en cultivos primarios de macrófagos de cerdo que la cepa parental.

8. Cepa viva atenuada de S. enterica serovar Choleraesuis, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque presenta mayor capacidad de proliferación en fibroblastos de lámina propia intestinal de cerdo que la cepa parental.

9. Aislado biológicamente puro de la cepa de S. enterica serovar Choleraesuis depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número 7268.

10. Uso de una cepa viva atenuada de S. enterica serovar Choleraesuis como la que se describe en las reivindicaciones 1 a 9, como vacuna frente a enfermedades infecciosas producidas por S. enterica serovar Choleraesuis en el cerdo.

11. Kit de vacunación para cerdos contra las enfermedades infecciosas producidas por S. enterica serovar Choleraesuis que comprenda un contenedor que incluya una cepa viva atenuada como la descrita en las reivindicaciones 1 a 9.

12. Uso de una cepa viva atenuada de S. enterica serovar Choleraesuis como la que se describe en las reivindicaciones 1 a 9, como vehículo vacunal de antígenos heterólogos.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 y 12, caracterizado porque la diferenciación entre la cepa viva atenuada y las cepas silvestres de S. enterica serovar Choleraesuis se realiza mediante cebadores diseñados en las regiones adyacentes a la secuencia del gen rpoS de S. enterica serovar Choleraesuis quedando limitadas dichas regiones adyacentes, respectivamente, por los genes nlpD y SC2853, ambos inclusive.

14. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque los cebadores utilizados son los descritos en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque la técnica utilizada para la diferenciación entre la cepa viva atenuada y las cepas silvestres de S. enterica serovar Choleraesuis es la técnica de la PCR.