PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR MIEMBROS DE PARES DE UNION ESPECIFICOS.

Procedimiento para producir una molécula con especificidad de unión para un objetivo particular,

cuyo procedimiento comprende: producir una población de partículas de bacteriófago filamentoso que presentan en su superficie una población de moléculas de unión que tienen un grupo de propiedades de unión, donde las moléculas de unión comprenden dominios de anticuerpo de unión a antígeno para miembros de pares de unión específicos complementarios, las moléculas de unión se presentan en la superficie de las partículas de bacteriófago filamentoso por fusión con una proteína de gen III de las partículas de bacteriófago filamentoso, y donde cada partícula de bacteriófago filamentoso contiene ácido nucleico que codifica la molécula de unión expresada del ácido nucleico y presentadas por la partícula en su superficie; seleccionar una partícula de bacteriófago filamentoso que presenta una molécula de unión con una propiedad de unión deseada, mediante la puesta en contacto de la población de partículas de bacteriófago filamentoso con un objetivo, a los efectos de que las moléculas de unión individuales presentadas sobre las partículas de bacteriófago filamentoso con la propiedad de unión deseada se unan a dicha diana; separar partículas de unión del bacteriófago filamentoso de la diana; recuperar partículas de bacteriófago filamentoso separadas que presentan una molécula de unión con la propiedad de unión deseada; aislar ácido nucleico que codifica la molécula de unión de partículas de bacteriófago filamentoso separadas; insertar ácido nucleico que codifica la molécula de unión, o un fragmento o derivado del mismo con especificidad de unión para la diana, en un sistema recombinante; y producir en el sistema recombinante separado de las partículas de bacteriófago filamentoso una molécula con especificidad de unión para la diana, donde la molécula es dicha molécula de unión o un fragmento o derivado del mismo con especificidad de unión para el objetivo

Procedimientos para producir miembros de pares de unión específicos.

La presente invención está relacionada con los procedimientos de producción de miembros de parejas de unión específicos. La presente invención también está relacionada con las moléculas de unión biológica producidas mediante estos procedimientos.

A causa de su elevada especificidad para un antígeno dado, la aparición de los anticuerpos monoclonales (Kohler, G. y Milstein, C., 1975, Nature, 256: 495) representaron un gran descubrimiento técnico con importantes consecuencias tanto científicas como comerciales.

Tradicionalmente, los anticuerpos monoclonales se generan mediante el establecimiento de una línea celular inmortal de mamífero que deriva de una única célula productora de inmunoglobulina que secreta una forma de una molécula de anticuerpo biológicamente funcional con una especificidad concreta. Debido a que la línea celular de mamífero secretora de anticuerpo es inmortal, las características del anticuerpo son reproducibles entre distintos lotes. Las propiedades clave de los anticuerpos monoclonales son su especificidad para un antígeno en particular y la reproducibilidad con la que pueden fabricarse.

Estructuralmente, el anticuerpo más sencillo (IgG) comprende cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante puentes disulfuro (ver Figura 1). Las cadenas ligeras existen en dos formas distintas denominadas kappa (K) y lambda (?). Cada cadena tiene una región constante (C) y una región variable (V). Cada cadena se organiza en una serie de dominios. Las cadenas ligeras tienen dos dominios, correspondientes a la región C y la otra a la región V. Las cadenas pesadas tienen cuatro dominios, uno correspondiente a la región V y tres dominios (1, 2 y 3) en la región C. El anticuerpo tiene dos brazos (cada brazo es una región Fab), cada uno de los cuales tiene una región VL y una VH asociada entre sí. Este par de regiones V (VL y VH) son las que difieren de un anticuerpo a otro (a causa de las variaciones en la secuencia aminoacídica), y las cuales juntas son responsables del reconocimiento del antígeno, proporcionando además un sitio de unión al antígeno (ABS). De forma más detallada, cada región V está formada por tres regiones que determinan su complementariedad (CDR) separadas por cuatro regiones estructurales (FR). Las CDR son las partes más variables de las regiones variables y realizan la función crítica de la unión al antígeno. Las regiones CDR derivan de muchas secuencias de líneas germinales potenciales mediante un proceso complejo que incluye recombinación, mutación y selección.

Se ha observado que la función de unión a los antígenos puede realizarse con fragmentos de un anticuerpo completo. Ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab formado por los dominios VL, VH, CL y CHl; (ii) el fragmento Fd formado por los dominios VH y CHl; (iii) el fragmento Fv formado por los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S., y col, (1989), Nature, 341: 544-546) formado por un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; y fragmentos F(ab')₂, un fragmento bivalente formado por dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra ("hinge").

Aunque los dos dominios del fragmento Fv están codificados por genes separados, se ha demostrado que es posible generar un engarzador sintético que permite hacerlos como una única cadena proteica (conocida como cadena única Fv (scFv); Bird, R.E., y col, (1988), Science, 242: 423-426, Huston, J.S., y col, (1988), Proc Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883) mediante técnicas de DNA recombinante. Estos fragmentos scFv se ensamblaron a partir de genes de monoclonales que se habían aislado previamente. En esta solicitud, los solicitantes describen un procedimiento para ensamblar fragmentos scFv a partir de los hbox{dominios VH y VL que no forman parte de un anticuerpo previamente aislado.}

Aunque los anticuerpos monoclonales, sus fragmentos y derivados han sido enormemente ventajosos, existen, sin embargo, una serie de limitaciones asociadas a ellos.

En primer lugar, las aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos monoclonales producidos por líneas celulares inmortales humanas tienen grandes perspectivas para el tratamiento de un rango amplio de enfermedades (Clinical Applications of Monoclonal Antibodies. Editado por E. S. Lennox, British Medical Bulletin, 1984. Publishers Churchill Livingstone). Desafortunadamente, son muy difíciles de establecer las líneas celulares humanas inmortales productoras de anticuerpo y dan bajos rendimientos de anticuerpos (aproximadamente 1 µm/ml). Sin embargo, líneas celulares de roedores equivalentes tienen un rendimiento elevado de anticuerpo (aproximadamente 100 mg/ml). No obstante, la administración continuada de estas proteínas extrañas de roedores a humanos puede provocar reacciones perjudiciales de hipersensibilidad. Por lo tanto, estos anticuerpos monoclonales derivados de roedores tienen un uso terapéutico limitado.

En segundo lugar, un aspecto clave en el aislamiento de los anticuerpos monoclonales es, en la práctica, cuantos clones distintos de células productoras de anticuerpos con distintas especificidades pueden establecerse y hacer un muestreo comparado con los que teóricamente son necesarios para aislar una célula productora de anticuerpos con las características deseadas de especificidad (Milstein, C. (1990), Royal Soc. Croonian Lecture, Proc. R. Soc. London B., 239: 1-16). Por ejemplo, se cree que el número de distintas especificidades expresadas en cualquier momento por los linfocitos del sistema inmunitario murino es de 10⁷ aproximadamente y esto es sólo una proporción pequeña del repertorio potencial de especificidades. Sin embargo, durante el aislamiento de una célula productora de anticuerpos típica con una especificidad deseada, el investigador sólo es capaz de hacer un muestreo de 10³ a 10⁴ especificidades individuales. El problema es peor en los humanos, en los que se tienen 10¹² especificidades linfocíticas aproximadamente, con la limitación de poder hacer un muestreo unas 10³ o 10⁴.

Este problema se ha solucionado parcialmente en laboratorios de animales mediante la utilización de regímenes de inmunización. Por lo tanto, cuando se quieren producir anticuerpos monoclonales provistos de una especificidad en contra de un epítopo en particular, se inmuniza a un animal con un inmunógeno que exprese dicho epítopo. El animal generará una respuesta inmune contra el inmunógeno y habrá una proliferación de linfocitos que tendrán especificidad frente al epítopo. Debido a esta proliferación de linfocitos con la especificidad deseada, es mucho más fácil detectarlos en el procedimiento de muestreo. Sin embargo, esta aproximación no funciona siempre cuando no está disponible un inmunógeno adecuado. Además, cuando se quieren producir anticuerpos monoclonales humanos (como por ejemplo, para su administración terapéutica, tal como se ha descrito anteriormente), dicha aproximación no es práctica o éticamente factible.

En los últimos años, estos problemas se han tratado, en parte, mediante la aplicación de los procedimientos del DNA recombinante para aislar y producir en bacterias como E. coli, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con capacidad de unión al antígeno.

Esta sustitución simple de las células inmortalizadas por células bacterianas como "fábricas" simplifica considerablemente los procedimientos para la preparación de grandes cantidades de moléculas de unión. Además, un sistema de producción recombinante permite la producción en este campo de anticuerpos y fragmentos de los mismos a la medida. Por ejemplo, es posible producir moléculas quiméricas con nuevas combinaciones de funciones de unión y efector, humanización de anticuerpos (como por ejemplo, regiones variables murinas combinadas con dominios conservados humanos o anticuerpos CDR murinos injertados en un FR humana) y nuevas moléculas de unión al antígeno. Además, la utilización de la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki, R.K., y col., (1988), Science, 239: 487-491) para aislar secuencias productoras de anticuerpo a partir de células (como por ejemplo, hibridomas y células B) tiene un gran potencial para disminuir el tiempo en que se pueden aislar especificidades. Los genes VH y VL amplificados se clonan directamente...

1. Procedimiento para producir una molécula con especificidad de unión para un objetivo particular, cuyo procedimiento comprende:

2. Procedimiento según la reivindicación 1 donde el ácido nucleico que codifica las moléculas de unión en la población se obtiene mediante la combinación in vitro de segmentos V no reordenados con segmentos D y J.

3. Procedimiento según la reivindicación 2 donde el ácido nucleico que codifica las moléculas de unión en la población es derivado por medio de mutagénesis in vitro de una secuencia de codificación de anticuerpo existente.

4. Una partícula de bacteriófago filamentosa que presenta en su superficie una molécula de unión que comprende un dominio de unión capaz de unir un miembro de pares de unión, donde la molécula de unión se presenta en la superficie de la partícula de bacteriófago filamentoso mediante fusión con una proteína de gen III de la partícula de bacteriófago filamentoso, donde el dominio de unión es un dominio de anticuerpo de unión a antígeno, conteniendo la partícula ácido nucleico que codifica la molécula de unión expresada desde el ácido nucleico y presentada por la partícula en su superficie.

5. Población de partículas de bacteriófago filamentoso según la reivindicación 4 que presentan una población de dichas moléculas de unión que tiene un rango de propiedades de unión.