Polipéptido variante que puede proceder de un polipéptido original,

presentando el polipéptido original actividad de exoamilasa no maltógena, comprendiendo dicho polipéptido variante la sustitución siguiente: A141P con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1 presentando el variante una termoestabilidad superior comparada con el polipéptido original cuando se prueba en las mismas condiciones y en el que dicho variante presenta actividad de exoamilasa no maltógena

Polipéptidos de Pseudomonas variantes que presentan una actividad de exoamilasa no maltógena y su utilización en la preparación de productos alimenticios.

Campo

La presente invención se refiere a polipéptidos, y a ácidos nucleicos que codifican a éstos, y a sus utilizaciones como exoamilasas no maltógenas en la producción de productos alimenticios. En particular, los polipéptidos proceden de polipéptidos con actividad de exoamilasa no maltógena, en particular, actividad de glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60).

Sumario

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido variante PS4 que puede proceder de un polipéptido original, presentando el polipéptido original actividad de exoamilasa no maltógena, cuyo polipéptido variante PS4 comprende la siguiente sustitución A141P con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 1.

Preferentemente, el polipéptido original comprende una exoamilasa no maltógena. Preferentemente, el polipéptido original comprende una glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60). Preferentemente, el polipéptido original es de la especie Pseudomonas o puede proceder de ella, preferentemente de Pseudomonas saccharophilia o Pseudomonas stutzeri. Preferentemente, el polipéptido original es una exoamilasa no maltógena procedente de Pseudomonas saccharophilia con una secuencia presentada como SEC. ID. nº: 1. Alternativamente, o además, el polipéptido original es una exoamilasa no maltógena procedente de Pseudomonas stutzeri con un número de registro P13507 en SWISS-PROT.

El polipéptido variante PS4 tiene una termoestabilidad mayor comparada con el polipéptido original cuando se prueba en las mismas condiciones. Preferentemente, la vida media (t_1/2), preferentemente a 60 grados C, aumenta el 15% o más, preferentemente 50% o más, aún más preferentemente 100% o más, en relación con el polipéptido original. Preferentemente, el polipéptido variante PS4 tiene una estabilidad de pH mayor comparada con el polipéptido original cuando se prueba en las mismas condiciones. Preferentemente, el polipéptido variante PS4 tiene 10% o más, preferentemente 20% o más, preferentemente 50% o más, estabilidad de pH.

En las formas de realización preferidas, el polipéptido variante PS4 comprende una sustitución A141P de prolina, junto con una sustitución G223A de alanina.

Preferentemente, comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por: PSac-A141P (SEC. ID. nº 3) y PStu-A141P (SEC. ID. nº 13).

Se proporciona, según un segundo aspecto de la presente invención, un ácido nucleico que comprende una secuencia que puede codificar un polipéptido variante PS4 según el primer aspecto de la invención.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una secuencia de ácido nucleico PS4 procedente de una secuencia original que codifica un polipéptido que tienen actividad de exoamilasa no maltógena y que comprende un codón que codifica un aminoácido en la posición especificada seleccionado de entre el grupo constituido por: 69P, 141P, 223A, 268P, 313P, 399P y 400P, con relación a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia presentada como SEC. ID. nº 1.

Como cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de ácido nucleico procedente de una secuencia original, secuencia original que puede codificar una exoamilasa no maltógena, secuencia de ácido nucleico que comprende una sustitución en uno o más restos de modo que el ácido nucleico codifica una o más de las siguientes mutaciones en las posiciones especificadas: 69P, 141P, 223A, 268P, 313P, 399P y 400P, con relación a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia presentada como SEC. ID. nº 1.

Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico de PS4 procede de una secuencia original que codifica una exoamilasa no maltógena por sustitución de uno o más restos de nucleótidos.

Preferentemente, comprende un codón CCA, CCC, CCG o CCT, en las posiciones 423-425, con relación a la numeración de la posición de una secuencia nucleotídica de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia presentada como SEC. ID. nº 10. Preferentemente, la secuencia original codifica una exoamilasa no maltógena que tiene una característica indicada anteriormente, o en la que un polipéptido codificado por el ácido nucleico tiene alguna de las características indicadas anteriormente.

Según un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un plásmido que comprende un ácido nucleico PS4 que codifica al segundo, tercer o cuarto aspecto de la invención.

La presente invención, en un sexto aspecto, proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico PS4 para el segundo, tercero o cuarto aspecto de la invención, o es capaz de expresar un polipéptido variante PS4 según el primer aspecto de la invención.

En un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora que comprende, preferentemente transformada con, un plásmido según el quinto aspecto de la invención o un vector de expresión según el sexto aspecto de la invención.

Según un octavo aspecto de la presente invención, los inventores proporcionan una célula que expresa un polipéptido según el quinto aspecto de la invención.

Preferentemente, la célula o la célula hospedadora es una célula bacteriana, micótica o de levadura.

Según un noveno aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de expresión de un polipéptido variante PS4, comprendiendo el procedimiento la obtención de una célula hospedadora según el séptimo aspecto de la invención, o una célula según el octavo aspecto de la invención, y expresar el polipéptido procedente de la célula o célula hospedadora, y opcionalmente purificar el polipéptido.

Se proporciona, según el décimo aspecto de la presente invención, un procedimiento de aumento de la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de un polipéptido introduciendo una sustitución A141P de aminoácido (con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 1), en un polipéptido original con actividad de exoamilasa no maltógena.

Como undécimo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de aumento de la termoestabilidad por un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de una exoamilasa no maltógena introduciendo una sustitución de A141P, con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 1.

Preferentemente, la secuencia de la exoamilasa no maltógena se altera alterando la secuencia de un ácido nucleico que codifica la exoamilasa no maltógena.

En las formas de realización todavía más preferidas, la exoamilasa no maltógena tiene una característica indicada anteriormente, o en la que un polipéptido codificado por el ácido nucleico tiene una característica como la indicada anteriormente.

Según el duodécimo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de producción de una variante de polipéptido PS4 con termoestabilidad aumentada, comprendiendo el procedimiento introducir una sustitución de aminoácido en el polipéptido original que tiene actividad de exoamilasa no maltógena, siendo la sustitución del aminoácido A141P con relación a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEC. ID. nº 1.

Preferentemente, la secuencia de un ácido nucleico que codifica el polipéptido original se altera al introducir la sustitución del aminoácido. Preferentemente, la secuencia original codifica una exoamilasa no maltógena, que posee preferentemente una característica indicada anteriormente o en la que un polipéptido codificado por el ácido nucleico presenta una característica indicada anteriormente.

Según un décimotercer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de un ácido nucleico que codifica una exoamilasa no maltógena,...

1. Polipéptido variante que puede proceder de un polipéptido original, presentando el polipéptido original actividad de exoamilasa no maltógena, comprendiendo dicho polipéptido variante la sustitución siguiente: A141P con respecto a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1 presentando el variante una termoestabilidad superior comparada con el polipéptido original cuando se prueba en las mismas condiciones y en el que dicho variante presenta actividad de exoamilasa no maltógena.

2. Polipéptido variante según la reivindicación 1, en el que el polipéptido original comprende una exoamilasa no maltógena.

3. Polipéptido variante según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido original comprende una glucano 1,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60).

4. Polipéptido variante según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el polipéptido original es o puede proceder de la especie Pseudomonas, preferentemente Pseudomonas saccharophilia o Pseudomonas stutzeri.

5. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido original es una exoamilasa no maltógena procedente de la exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia que presenta una secuencia representada como SEC. ID. nº 1 o SEC. ID. nº 9.

6. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipéptido original es una exoamilasa no maltógena procedente de Pseudomonas stutzeri que rpesenta una secuencia representada como SEC. ID. nº 11 o SEC. ID. nº 19.

7. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la vida media (t_1/2), a 60 grados C, aumenta 15% o más en relación con el polipéptido original.

8. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una sustitución G223A de alanina.

9. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por: SEC. ID. nº 3 (PSac-A141P) y SEC. ID. nº 13 (PStu-A141P).

10. Ácido nucleico que comprende una secuencia que puede codificar un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 10, que procede de una secuencia original que codifica una exoamilasa no maltógena por sustitución de uno o más restos nucleotídicos.

12. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 10 u 11, que comprende un codón CCA, CCC, CCG o CCT, en las posiciones 423-425, con relación a la numeración de la posición de una secuencia nucleotídica de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia que presenta una secuencia representada como SEC. ID. nº 10.

13. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 12, en la que la secuencia original codifica una exoamilasa no maltógena que presenta una característica como se ha expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o en la que un polipéptido codificado por el ácido nucleico presenta cualquiera de las características expuestas en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

14. Plásmido que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.

15. Vector de expresión que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, o que puede expresar un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

16. Célula hospedadora que comprende un plásmido según la reivindicación 14 o un vector de expresión según la reivindicación 15.

17. Célula que expresa un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

18. Célula hospedadora según la reivindicación 16, o célula según la reivindicación 17, que es una célula bacteriana, de hongo o de levadura.

19. Procedimiento para expresar un polipéptido variante, comprendiendo dicho procedimiento la obtención de una célula hospedadora según la reivindicación 18, o una célula según la reivindicación 17, y expresar el polipéptido a partir de la célula o de la célula hospedadora.

20. Procedimiento para aumentar la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de un polipéptido introduciendo la sustitución del aminoácido: A141P (en relación con la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1) en un polipéptido original que presenta actividad de exoamilasa no maltógena.

21. Procedimiento de aumento de la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de una exoamilasa no maltógena introduciendo una sustitución de A141P, en relación con la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1.

22. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, en el que la secuencia de la exoamilasa no maltógena se altera alterando la secuencia de un ácido nucleico que codifica la exoamilasa no maltógena.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que la exoamilasa no maltógena presenta una característica como se ha expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o en el que un polipéptido codificado por el ácido nucleico presenta una característica expuesta en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.

24. Procedimiento de producción de un polipéptido variante con termoestabilidad aumentada, comprendiendo el procedimiento introducir una sustitución de aminoácido en un polipéptido original que presenta actividad de exoamilasa no maltógena, siendo la sustitución del aminoácido A141P con relación a la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1.

25. Procedimiento según la reivindicación 23 ó 24, en el que la secuencia de un ácido nucleico que codifica el polipéptido original se altera para introducir la sustitución del aminoácido.

26. Procedimiento según la reivindicación 24 ó 25, en el que la secuencia original codifica una exoamilasa no maltógena, que presenta una característica como se ha expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, o en el que un polipéptido codificado por el ácido nucleico presenta una característica como se ha expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

27. Procedimiento para aumentar la termoestabilidad de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento alterar la secuencia de un ácido nucleico que codifica una exoamilasa no maltógena, comprendiendo el procedimiento introducir en la secuencia un codón que codifica el resto de aminoácido 141P, en relación con la numeración de la posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia representada como SEC. ID. nº 1.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, en el que el polipéptido se aísla y purifica.

29. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como una amilasa.

30. Procedimiento para tratar un almidón que comprende poner en contacto el almidón con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y permitir que el polipéptido genere a partir del almidón uno o más productos lineales.

31. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, una célula o una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en la preparación de un producto alimenticio.

32. Procedimiento para la preparación de un producto alimenticio que comprende mezclar un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con un ingrediente alimenticio.

33. Utilización según la reivindicación 31, o procedimiento según la reivindicación 32, en los que el producto alimenticio comprende una masa o un producto de masa.

34. Utilización según la reivindicación 31 ó 33, o procedimiento según la reivindicación 32 ó 33, en los que el producto alimenticio comprende una masa frita, frita en aceite abundante, tostada, horneada, cocida al vapor o cocida.

35. Utilización o procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en los que el producto alimenticio es un producto de panadería.

36 Procedimiento para la preparación de un producto de panadería que comprende: (a) proporcionar un medio de almidón; (b) añadir al medio de almidón un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y (c) aplicar calor al medio de almidón durante o después de la etapa (b) para producir un producto de panadería.

37. Utilización o procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 36, en los que el producto alimenticio es un pan, un pan cocido al vapor o un pastel de arroz.

38. Utilización o procedimiento según la reivindicación 31 ó 32, en los que el producto alimenticio es un pienso para animales.

39. Composición de mejorador para una masa, en la que la composición de mejorador comprende un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y por lo menos un ingrediente de la masa o un aditivo para la masa adicional.

40. Composición que comprende una harina y un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

41. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en un producto de pan para retardar o reducir la retrogradación perjudicial, preferentemente el endurecimiento, del producto de pan.

42. Combinación de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, junto con Novamyl, o una variante, homólogo, o mutantes de la misma con actividad de alfa amilasa, o una composición que comprende los mismos.

43. Utilización de una combinación o composición según la reivindicación 42 para una utilización o procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37.