Método para detectar una variación en una molécula de ácido nucleico comprendiendo dicho método los pasos de:

(a) prever ácidos nucleicos; (b) transformar los ácidos nucleicos en un confórmero o varios confórmeros espaciales de ácidos nucleicos de una sola hebra; (c) separar el (los) confórmero(s) bajo condiciones nativas; (d) cambiar una condición de separación al menos una vez durante la separación, donde el cambio puede impartir un cambio de conformación en el (los) confórmero(s); (e) detectar el patrón de movilidad del (de los) confórmero(s); y (f) comparar el patrón de movilidad del (de los) confórmero(s) con un patrón de movilidad de un confórmero de ácido nucleico de control para con ello detectar una variación en la molécula de ácido nucleico, donde la condición es la temperatura, y donde se baja la temperatura durante la separación

Polimorfismo de conformación de hebra única multitemperatura (MSSCP).

Ámbito de la invención

Los métodos de la presente invención se refieren a unos medios para la rápida detección y caracterización de secuencias y variabilidad de secuencias de ácidos nucleicos. La presente invención se refiere a los medios para variar la movilidad de separación de ácidos nucleicos de una sola hebra de manera dependiente de la temperatura. Las variaciones de la movilidad de separación se usan para la detección de cambios de una sola base conocidos y desconocidos en ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

La variabilidad genética que se observa entre los especímenes de cualquier especie es el resultado de polimorfismo desarrollado durante la evolución biológica y de mutaciones espontáneas acumuladas durante la vida de los individuos.

El establecer la correlación entre las variaciones genéticas, el ambiente y el fenotipo observado de un organismo (o de una población) podría proporcionar una información vital para entender los mecanismos básicos de la vida.

Uno de los polimorfismos que se observan más a menudo es una distinción de un solo par de pases en la secuencia de una hebra de ácido nucleico, en comparación con la hebra de ácido nucleico que se da con la mayor prevalencia (tipo salvaje), lo cual se denomina Polimorfismo de un Solo Nucleótido (SNP). Cuando se produce SNP en el gen que codifica para una proteína estructural o su región reguladora, tal polimorfismo genético podría influenciar la funcionalidad de la proteína codificada, de las células y del fenotipo de todo el organismo.

En la mayoría de los casos, en los organismos superiores el fenotipo que se observa es el resultado de la interacción de varios productos genes. Puesto que el mecanismo de compensación/ajuste que existe al nivel de la proteína podría influenciar al fenotipo final, el patrón de polimorfismo y la frecuencia de mutación que están en correlación con cualquier fenotipo pueden ser tan sólo ligeramente distintos en un grupo afectado en comparación con los del control. Para establecer tal correlación, se requieren habitualmente estudios de asociación del genoma completo en cohortes de población.

Puesto que los beneficios de tales estudios podrían mejorar mucho la vida humana, p. ej. introduciendo la diagnosis y la farmacogenómica basadas en DNA en la rutina hospitalaria, hay gran necesidad de establecer una metodología fiable de análisis de mutaciones y polimorfismos de DNA a gran escala del genoma en cohortes de población. A pesar del hecho de que la secuenciación del DNA está pasando a ser una metodología cada vez más rutinaria, ninguno de los otros métodos técnicos que en realidad existen para la detección de la variación de la secuencia genética podría ser aplicado p. ej. para estudios genéticos del genoma humano completo en cohortes de población a un aceptable nivel de consumo de tiempo y de costes.

En la actualidad podrían distinguirse al menos tres pasos en el proceso de detección de mutaciones/SNPs. En el primer paso hay que tomar una decisión sobre qué regiones/genes del genoma tienen que analizarse. En la segunda etapa tiene que llevarse a cabo un cribaje para detectar la presencia de mutaciones/SNPs en los genes/las regiones seleccionados, y en la última etapa podría ser necesaria una secuenciación de las muestras seleccionadas.

El proceso de detección de mutaciones/SNPs depende de la cantidad de NA (NA = ácido nucleico) diana en la muestra analizada. Podrían usarse varios métodos estándar para la purificación de ácidos nucleicos desde el material de partida, y también están disponibles los de una amplia selección de kits (kits = conjuntos de utensilios y materiales) comerciales para la purificación de ácidos nucleicos.

Cuando la cantidad aislada de ácidos nucleicos diana es suficiente para una detección específica, podrían aplicarse los métodos llamados de detección directa de mutaciones.

Los métodos para la detección directa de secuencias específicas en ácidos nucleicos están en su mayoría basados en la hibridación de NA/NA (como p. ej. el método del DNA ramificado bDNA - Urdea et al., Gene 61:253-264 (1987)) o en la interacción de proteína/NA (Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción - RFLP).

Sin embargo, cuando la cantidad de ácidos nucleicos diana en la muestra analizada es demasiado pequeña para su análisis directo, es necesario un paso de amplificación de los fragmentos de los ácidos nucleicos seleccionados. El método más popular que se usa para la amplificación de los fragmentos de los ácidos nucleicos diana es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) como se describe en las Patentes U.S. Núms. 4.683.195 y 4.683.202 concedidas a Mullis et al. El proceso comprende los pasos de tratar hebras complementarias independientes del ácido nucleico con un exceso molar de dos cebadores oligonucleotídicos, extender los cebadores por medio de DNA polimerasa termoestable para formar productos de extensión de cebadores complementarios, que actúan como plantillas para sintetizar la deseada secuencia de ácido nucleico, y detectar la secuencia así amplificada. Los pasos de la reacción pueden realizarse paso a paso o bien simultáneamente, y pueden ser repetidos tantas veces como se desee.

Están entre otros métodos que podrían ser usados para la amplificación de ácidos nucleicos los siguientes:

Teniendo amplificados los ácidos nucleicos diana, podrían usarse varios métodos para la posterior detección y caracterización de mutaciones y polimorfismos. Todos esos métodos podrían dividirse en dos grupos:

El amplio estudio de las técnicas usadas para la detección de SNPs/mutaciones fue presentado en la publicación Electrophoresis Nº 6/99, vol. 20 o en la US 5719028.

Los métodos biológicos (específicos) están basados en el reconocimiento de una específica secuencia de ácidos nucleico, y por consiguiente son primariamente adecuados para la detección de SNPs/mutaciones conocidos. En contraste con ello, el segundo grupo de métodos no requiere un previo conocimiento de las secuencias investigadas, y estos métodos se usan para la detección y/o identificación de cualesquiera SNPs/mutaciones puntuales. Esto podría usarse p. ej. para el cribaje de regiones genéticas altamente variables. Un ejemplo de los métodos biológicos para la detección de diversidad genética podría ser la PCR competitiva, descrita en la Patente U.S. Nº 5.582.989. En ese método se usan dos conjuntos distintos de pares de cebadores para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana. Según este método, un conjunto de cebadores reconoce la secuencia de tipo salvaje y el otro conjunto reconoce la mutación puntual seleccionada. Otro ejemplo es un método que se usa para la detección de la presencia de SNPs específicos en los ácidos nucleicos diana sobre la base de la Amplificación Aleloespecífica (ASO) descrita por Shuber (1997) Pat. US Nº 5.633.134. Desgraciadamente, la reacción PCR podría generar resultados falsos, debido a la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos para las cuales los cebadores no son perfectamente complementarios. En consecuencia, en dependencia de las condiciones de reacción (temperatura, fuerza iónica) cualquier conjunto de cebadores competitivos...

1. Método para detectar una variación en una molécula de ácido nucleico comprendiendo dicho método los pasos de:

donde la condición es la temperatura, y donde se baja la temperatura durante la separación.

2. El método de la reivindicación 1, donde la variación es una diferencia de una sola base en dicha molécula de ácido nucleico en comparación con dicho control.

3. El método de la reivindicación 2, donde dicha diferencia de una sola base es un polimorfismo de un solo nucleótido.

4. El método de la reivindicación 2, donde dicha diferencia de una sola base es una mutación.

5. El método de la reivindicación 2, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende DNA de doble hebra.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende RNA.

7. El método de la reivindicación 1, donde dichos ácidos nucleicos son obtenidos de un cultivo o muestra de tejido, de células, de bacterias o de virus, transcritos in vitro desde una plantilla de DNA o sintetizados químicamente.

8. El método de la reivindicación 1, donde dichos ácidos nucleicos se obtienen por PCR.

9. El método de la reivindicación 1, donde dicha transformación de ácidos nucleicos comprende el paso de someter a dichos ácidos nucleicos a medios físicos, químicos o enzimáticos o a una combinación de los mismos, donde es desorganizada la estructura secundaria de dicho ácido nucleico.

10. El método de la reivindicación 9, donde dichos medios físicos, químicos o enzimáticos son seleccionados de entre los miembros del grupo que consta de bajo pH, alto pH, alta temperatura, baja concentración salina, urea o formamida.

11. El método de la reivindicación 10, donde dicha transformación comprende el paso de calentar dichos ácidos nucleicos hasta aproximadamente 94ºC.

12. El método de la reivindicación 1, donde dicho paso de separación es seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de electroforesis o cromatografía.

13. El método de la reivindicación 12, donde dicho paso de separación es electroforesis en gel de poliacrilamida.

14. El método de la reivindicación 1, donde el paso de cambiar la condición durante dicha separación cambia la energía total de dicho confórmero espacial de ácido nucleico de una sola hebra.

15. El método de la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico contiene una etiqueta fluorescente.

16. El método de la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico contiene una etiqueta electromagnética.

17. El método de la reivindicación 15, que comprende adicionalmente la detección de dicha etiqueta fluorescente.

18. El método de la reivindicación 16, que comprende adicionalmente la detección de dicha etiqueta electromagnética.

19. El método de la reivindicación 1, donde dicha detección es por coloración con plata.

20. El método de la reivindicación 1, donde el confórmero de control es una secuencia de tipo salvaje.

21. El método de la reivindicación 1, donde el confórmero de control es una secuencia mutante.

22. El método de la reivindicación 1, donde el confórmero de control contiene una variación de secuencia.

23. El método de la reivindicación 1, que comprende además los pasos de: