Procedimiento de obtención de la vacuna PA-Vac anti-Pseudomonas anguilliseptica,

para la prevención de la enfermedad pseudomoniasis en peces cultivados producida por el microorganismo Pseudomonas anguilliseptica. El procedimiento se caracteriza por incluir en la vacuna las células bacterianas inactivadas con formol de dos cepas de Pseudomonas anguilliseptica con distinto origen geográfico y de hospedador (CECT 899T y CECT 7245), representantes de los dos serotipos descritos en esta especie bacteriana. La vacuna presenta niveles muy eficaces de protección de peces contra la pseudomoniasis. La vacuna es de aplicación en el sector de la acuicultura

Procedimiento de obtención de la vacuna anti-Pseudomonas anguilliseptica (PA-Vac) para la prevención de la enfermedad pseudomoniasis en peces cultivados.

Procedimiento de obtención de la vacuna anti-Pseudomonas anguilliseptica (PA-Vac) para la prevención de la enfermedad pseudomoniasis en diferentes especies de peces cultivados. La vacuna está basada en la combinación de cepas, causantes de mortalidades en peces, aisladas en distintas zonas geográficas y de diferentes hospedadores, que difieren en sus características antigénicas y genéticas.

La pseudomoniasis, producida por Pseudomonas anguilliseptica es una de las principales enfermedades emergentes en acuicultura marina debido a las pérdidas económicas que ocasiona, especialmente en cultivos de anguila, dorada y lubina. Otras especies afectadas son rodaballo, besugo y bacalao.

Desde 1997 se han detectado con cierta frecuencia epizootias de pseudomoniasis en diversas piscifactorías españolas, afectando principalmente a dorada y en menor medida a rodaballo. Todas las cepas aisladas de estas epizootias presentan gran homogeneidad bioquímica y antigénica (Lopez-Romalde y col., 2003a: Journal of Aquatic Animal Health, 5: 39-47; López-Romalde y col., 2003b: Veterinary Microbiology 94: 325-333). Sin embargo, se han detectado diferencias antigénicas con las cepas de este patógeno aisladas de anguila en otros países europeos y en Japón (López-Romalde y col. 2003b op. cited). Estudios de caracterización genética han demostrado, asimismo, la existencia de dos grupos genéticos mayoritarios, que se corresponden con los grupos serológicos (López-Romalde et al., 2003ª op. cited).

Preparación

A partir de preinóculos en fase logarítmica de crecimiento de dos cepas de Pseudomonas anguilliseptica, CECT 899 y CECT 7245, se inoculan por separado matraces de dos litros conteniendo un litro de medio de cultivo tripticasa soja caldo (TSC: triptona 17 g/L; peptona de soja 3 g/L; glucosa 2,5 g/L; fosfato bipotásico 2,5 g/L; cloruro sódico 10 g/L; pH 7,3 pm 0,2) suplementado con un 0,5 % de cloruro sódico.

La incubación se realiza a 25ºC durante 48 horas. Cuando el cultivo alcanza una densidad óptica de 1 (Absorban- cia₅₅₀) (aproximadamente 10¹⁰ células/mL), se le añade formol a una concentración final de 0,35% para matar las bacterias, y se mantiene durante tres horas más en agitación, al cabo de las cuales se transfieren los matraces a 4ºC. Las dos cepas empleadas se mezclan en proporción del 50%.

El control de esterilidad se lleva a cabo sembrando la mezcla vacunal en placas de TSA-1 (Triptona soja agar suplementado con un 0,5% de cloruro sódico) y en tubos de tioglicolato, incubando durante 72 horas a 25 y 37ºC respectivamente.

El control de especificidad se realiza mediante aglutinación en portaobjetos, utilizando como antígeno las células enteras empleadas en la fabricación de la vacuna.

La vacuna debe ser conservada a 4ºC hasta su utilización.

Modo de administración

Esta vacuna debe administrarse por inyección intraperitoneal. Para ello, se inoculan los peces con 0,1 mL/pez (en peces menores de 100 g) ó 0,2 mL/pez (en peces mayores de 100 g) de mezcla vacunal sin diluir.

Las cepas de Pseudomonas anguilliseptica empleadas en esta vacuna son CECT 899^T (cepa tipo de la especie) aislado de anguila en Japón y TW P1 (aislado español de dorada) (depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 7245).

La eficacia de esta vacuna fue evaluada en rodaballo y dorada tanto a escala de laboratorio como a escala de campo. La potencia, expresada como Porcentaje de Supervivencia Relativa (RSP) ha sido en ambos casos superior al 90%.

1. Cepa de Pseudomonas anguilliseptica TW P1, aislada de un epizootia ocurrida en España y depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de accesión CECT 7245.

2. Composición de la vacuna PA-Vac anti-Pseudomonas anguilliseptica que incluye las células inactivadas por formol de dos cepas de este patógeno: la cepa tipo de la especie bacteriana (CECT 899T), aislada de anguila en Japón y el aislado español TW P1 (CECT 7245), que difieren en sus características serológicas y genéticas.

3. Procedimiento para la obtención de la composición descrita en la reivindicación 2, caracterizado por la obtención de las células bacterianas en cultivos líquidos de medio Tripticasa soja caldo (TSC) suplementado con 0,5% de cloruro sódico, por su inactivación con formol a una concentración final del 0,35% durante 4 horas a temperatura ambiente y porque la concentración final de células bacterianas es de 10¹⁰ células/mL.

4. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque la proporción de mezcla de ambas cepas en la vacuna es del 50%.

5. Vacuna PA-Vac anti-Pseudomonas anguilliseptica obtenida por el procedimiento de las reivindicaciones 3 y 4 para la prevención de la enfermedad pseudomoniasis en peces cultivados.