MONITORIZACION DE LA ENFERMEDAD DE HUNTINGTON.

Método de monitorización de la evolución de la enfermedad de Huntington en una muestra diagnóstica de un tejido corporal válido tomada de un sujeto humano vivo,

que comprende detectar la concentración de precursor de clusterina en la muestra diagnóstica y compararla con una muestra anterior del mismo sujeto o con un valor patrón típico de un estadio de la enfermedad

Monitorización de la enfermedad de Huntington.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a un método de monitorización de la evolución de la enfermedad de Huntington (EH).

La enfermedad de Huntington es una enfermedad hereditaria autosómica dominante y está provocada por una expansión de la repetición CAG en el gen IT15 del cromosoma 4, dando como resultado la producción de un largo tramo de poliglutamina. La enfermedad está asociada con una degeneración grave y progresiva del cuerpo estriado y la corteza del cerebro, y se caracteriza clínicamente por un trastorno del movimiento, problemas de comportamiento y demencia. La edad media de aparición es de 40 años y la esperanza de vida es de 15-20 años.

La enfermedad es clínicamente heterogénea y existen dificultades en la evaluación de la evolución de la enfermedad en esta dolencia que han conducido a la necesidad de que se desarrollen métodos adicionales para ayudar al desarrollo de ensayos terapéuticos para esta enfermedad.

Singhrao et al. dieron a conocer niveles de clusterina elevados en muestras de cerebro post mortem de pacientes con EH (1999).

Sumario de la invención

La invención proporciona el uso de precursor de clusterina en o para la monitorización de la evolución de la EH. Se ha encontrado que esta proteína marcadora se expresa de manera diferencial en electroforesis dimensional de muestras de plasma y experimentos de obtención de perfil de espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante desorción-ionización por láser de superficie (SELDI).

Las proteínas marcadoras y sus características de expresión diferencial son tal como sigue:

1. Proteína presente en una concentración aumentada en una muestra de EH, en comparación con un control: precursor de clusterina (número de registro de SwissProt P 10909);

2. Proteínas adicionales presentes en una concentración aumentada o disminuida en una muestra de EH, en comparación con un control, tal como se enumera a continuación;

3. Proteínas presentes en una concentración aumentada en muestras de EH, en comparación con un control: beta-actina (número de registro de SwissProt P60709) y precursor de apolipoproteína A-IV (número de registro de SwissProt P06727).

La invención se define mediante las reivindicaciones.

La proteína marcadora puede estar presente en el tejido corporal en cualquier forma biológicamente relevante, por ejemplo, en forma glicosilada, fosforilada, multimérica o de precursor.

La expresión "expresado de manera diferencial" significa que los puntos que llevan proteína están presentes a una densidad óptica superior o inferior en el gel de la muestra tomada para el diagnóstico ("la muestra diagnóstica") que el gel de un control u otra muestra comparativa. Se deduce que las proteínas están presentes en el plasma de la muestra diagnóstica a una concentración superior o inferior que en el control u otra muestra comparativa.

El término "control" se refiere a un sujeto humano normal, es decir, uno que no padece una enfermedad neurodegenerativa, y también a una muestra tomada del mismo sujeto humano que proporcionó la muestra diagnóstica, pero en un momento anterior.

La terminología "concentración aumentada/disminuida...en comparación con una muestra de un control" no implica que se acometa realmente una etapa de comparación, dado que en muchos casos será obvio para el experto que la concentración es anómalamente alta. Además, cuando están monitorizándose los estadios de la EH de manera progresiva, la comparación realizada puede ser con la concentración observada previamente en el mismo sujeto en la evolución anterior de la enfermedad.

La expresión "pareja de unión" incluye una sustancia que reconoce o tiene afinidad por la proteína marcadora. Puede estar o no marcada en sí misma.

La expresión "proteína marcadora" incluye todas las formas biológicamente relevantes de la proteína identificada.

El término "diagnóstico", tal como se usa en el presente documento, incluye la determinación de si la enfermedad relevante está presente o ausente y también incluye, en relación con la enfermedad de Huntington, la determinación del estadio al que ha evolucionado. El diagnóstico puede servir como la base de un pronóstico respecto al desenlace futuro para el paciente y para monitorizar la eficacia del tratamiento.

La expresión "tejido corporal válido" significa cualquier tejido en el que puede esperarse razonablemente que una proteína marcadora se acumule en relación con la EH. Aunque será principalmente un fluido corporal, también incluye tejido cerebral o nervioso.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una fotografía de un gel bidimensional típico realizada para fines analíticos, mediante el método descrito en el ejemplo 1 más adelante. Se muestra el peso molecular (masa molecular relativa) en la ordenada en kiloDaltons. Se muestran los marcadores de peso molecular en el lado izquierdo. Se muestra el punto isoeléctrico (pI) en la ordenada, aumentando de izquierda a derecha.

La figura 2 es similar a la figura 1, pero mostrando los puntos 1713 y 1960 en una muestra derivada de un paciente con EH.

Las figuras 3, 4 y 5 muestran gráficas de caja y bigote de los resultados de inmunotransferencias de tipo Western para un marcador para la EH, tal como se explica más completamente en el ejemplo 2.

La figura 6 muestra gráficas de dispersión de espectros duplicados del conjunto de datos Q10-Tris tal como se explica en el ejemplo 3.

La figura 7 es un diagrama de Venn que presenta el número y el solapamiento de picos estadísticamente diferentes en tres conjuntos de datos experimentales, tal como se explica en el ejemplo 3.

La figura 8 muestra gráficas de caja y bigote de intensidades de pico significativamente diferentes, tal como se explica en el ejemplo 3.

Descripción

Un método de diagnóstico preferido comprende realizar un ensayo de unión para detectar la proteína marcadora. Puede usarse cualquier pareja de unión razonablemente específica. Preferiblemente, la pareja de unión está marcada. Preferiblemente, el ensayo es un inmunoensayo, especialmente entre el marcador y un anticuerpo que reconoce la proteína, especialmente un anticuerpo marcado. Puede ser un anticuerpo producido contra parte o todo de la misma, lo más preferiblemente un anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal anti-ser humano de alta especificidad para la proteína marcadora.

Por tanto, las proteínas marcadoras descritas anteriormente son útiles para el fin de producir anticuerpos frente a las mismas que pueden usarse para detectar la concentración aumentada o disminuida de las proteínas marcadoras presentes en una muestra diagnóstica. Tales anticuerpos pueden producirse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en el campo del inmunodiagnóstico.

Los anticuerpos pueden ser frente a cualquier estado biológicamente relevante de la proteína. Por tanto, por ejemplo, podrían producirse contra la forma no glicosilada de una proteína que existe en el organismo en una forma glicosilada, contra una forma más madura de una proteína precursora, por ejemplo, menos su secuencia señal, o contra un péptido que porta un epítopo relevante de la proteína marcadora.

La muestra puede tomarse de cualquier tejido corporal válido, especialmente fluido corporal, de un sujeto (humano), pero preferiblemente sangre, plasma o suero. Otros fluidos corporales que pueden usarse incluyen líquido cefalorraquídeo (LCR), orina y lágrimas.

Según otro método, el diagnóstico se lleva a cabo post mortem en un tejido corporal de origen neurológico relevante para la EH, tal como a partir del cerebro o los nervios. El tejido se trata previamente para extraer proteínas del mismo, incluyendo las que estarían presentes en la sangre del fallecido, de modo que se garantice que las proteínas marcadoras relevantes especificadas anteriormente estarán presentes en una muestra positiva. Para los fines de esta memoria descriptiva de patente, un extracto de este tipo es equivalente a un fluido corporal.

A modo de ejemplo, se disecciona tejido cerebral y se solubilizan las subsecciones en tampón de lisis de gel 2-D (por...

1. Método de monitorización de la evolución de la enfermedad de Huntington en una muestra diagnóstica de un tejido corporal válido tomada de un sujeto humano vivo, que comprende detectar la concentración de precursor de clusterina en la muestra diagnóstica y compararla con una muestra anterior del mismo sujeto o con un valor patrón típico de un estadio de la enfermedad.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende detectar un aumento de la concentración de precursor de clusterina en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra anterior del mismo sujeto.

3. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la detección se realiza en la muestra diagnóstica mediante un ensayo de unión para detectar el precursor de clusterina.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el ensayo de unión comprende provocar que el precursor de clusterina de la muestra diagnóstica interaccione con una pareja de unión específica y detectar la interacción.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la pareja de unión específica es un anticuerpo marcado que reconoce al precursor de clusterina.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo está inmovilizado sobre una fase sólida.

7. Método según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo está inmovilizado sobre perlas o como un chip.

8. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra diagnóstica se somete a electroforesis en gel bidimensional para producir un gel teñido y se detecta una concentración alterada del precursor de clusterina mediante un aumento o una disminución de la intensidad de un punto que contiene proteína en el gel teñido, en comparación con un gel control correspondiente.

9. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el tejido corporal válido es un fluido corporal.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el tejido corporal válido es de tejido cerebral o nervioso.

11. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que se diagnostica un estadio particular de la enfermedad de Huntington.

12. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que un aumento del nivel de precursor de clusterina en comparación con el nivel previo en una muestra anterior del mismo individuo indica un aumento en la gravedad de la enfermedad.

13. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la evolución de la enfermedad de Huntington en un sujeto se monitoriza midiendo el nivel de precursor de clusterina, y opcionalmente beta actina y/o precursor de apolipoproteína A-IV, por lo cual un aumento del nivel de una o más de estas proteínas en comparación con el nivel previo respectivo de una o más proteínas en una muestra anterior del mismo individuo indica un aumento en la gravedad de la enfermedad.

14. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la monitorización de la evolución de la enfermedad de Huntington se usa para monitorizar la eficacia del tratamiento.

15. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que otra enfermedad, que puede ser neurológica o no, se diagnostica en la misma muestra de tejido corporal, mediante un método que comprende detectar un aumento de la concentración de otra proteína en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano normal, control.